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Retrovirus Packaging Kitを用いた一過性の組換えレトロウイルス産生

[前日]準備
細胞(G3T-hi、293細胞など)を60 mmφdishに2×106 cells/dishで接種し、培養する。
[1日目]トランスフェクション
(トランスフェクション試薬、滅菌精製水は室温に戻しておき、以下の操作は無菌的に行うこと)
 (1)細胞が80%コンフルエントであることを確認し、培地を交換する。
  (10%FBSおよび25μM Chloroquineを含むDMEM, 3 ml)
 (2)DNA混合液の調製
   以下の溶液を5 ml容のポリスチレン製丸底チューブで混合する。
組換えレトロウイルスベクタープラスミド(1 μg/μl水溶液) 10 μl
pGP Vector 5 μl
pE-eco Vector or pE-ampho Vector 5 μl
2 M CaCl2 62 μl
滅菌精製水 418 μl

 (3) リン酸カルシウム沈殿の作製およびトランスフェクション
・Transfection buffer 500 μlをはかりとる(電動ピペッターを使用)。
・(2) の液に緩やかに加える(チューブを振りながら混ぜる)。
・添加後、直ちにピペッターの排出を利用してバブリングする(10~20秒)。
・1~2分以内にdishに均一に滴下し、培地と混合する。
・37℃、5% CO2インキュベーターで培養する(7~11時間)。
(顕微鏡観察で細胞に粉雪が降りかかったような状態が見えればリン酸カルシウム沈殿の形成は成功している)
・培地を交換する(10% FBS含有DMEM, 4 ml)。

[2日目]培地交換
トランスフェクションから24時間後にさらに培地を交換する
(10% FBS含有DMEM, 4 ml)

[3日目]ウイルス液の回収
トランスフェクションから48時間後、上清を0.45μmフィルターでろ過し、組換えレトロウイルス液とする。調製したウイルス液を、直ちに使用しない場合は、小分けして-80℃で保存し、凍結融解の繰り返しを避ける。

得られたウイルス液の力価は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えベクターの大きさや、トランスフェクション効率などによって左右されるが、通常、一過性に105~107感染ユニット/mlの力価が得られる。
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