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E-カドヘリン抗体によるパラフィン包埋切片の免疫組織染色

使用抗体Human E-Cadherin Monoclonal Anitbody(HECD-1、SHE78-7)
腑活用buffer10 mMクエン酸buffer(pH6.0)
TBSトリスアミノメタン1.24 g
トリスアミノメタン塩酸塩6.27 g
NaCl8.77 g
全量1000 ml

※TBSの作製にはTBS powder(製品コード T903)が便利です。組織染色を行う場合、TBSへの塩化カルシウムの添加は特に必要ありません。

1.脱パラフィン(それぞれ100~150 ml容器を用いて行う)
キシレン5分×3回
100%エタノール5分×2回
90%エタノール5分×1回
80%エタノール5分×1回
流水洗浄2分
蒸留水5分

2.抗原の腑活化
(1) 耐熱性のビーカーあるいはプラスチック製容器(電子レンジで使用可能なもの)を2個準備し、その中に切片を浸すのに充分量の腑活用buffer(10 mM クエン酸buffer, pH6.0)を加え、家庭用電子レンジのあたため(調理)モード(約500~900 W)で5分間照射する(preincubation)。
この時、密閉した容器を使用すると突沸し危険ですので、必ず蓋をずらして照射してください。
(2) 脱パラフィンした組織切片を片方の容器に浸し、同様に家庭用電子レンジのあたため(調理)モード(約500~900 W)で5分間照射する。
(3) 切片をもう一方のバッファーの入った容器に移し替えて、(2)と同様に電子レンジで照射する。
(4) ひとつの切片に対して6~8回(約30~40分)照射・移し替えの操作を繰り返し行ない、照射する毎にバッファーの入った容器を交換する(2つの容器を交互に使用する。)
(5) 照射後、電子レンジから取りだし、そのまま室温で15~20分間放置冷却する。
(6) TBSに5分間浸す。
* 賦活操作中に切片が剥離しないように、スライドガラスは必ずシランコーティングしたものをご使用ください。
* TPX染色バットと染色用トレイ(テラオカ製)を用いると、20枚のスライドを同時に処理できて便利です。

3. 内因性Peroxidaseのブロッキング
3%過酸化水素溶液5~15分
TBS洗浄5分

4.非特異的反応の阻止
ブロックエース(大日本製薬社製)原液または1%BSA/TBS
5~15分反応後TBSですすぐ

5. 一次抗体反応
抗体を25%ブロックエース/TBS、または1%BSA/TBSで下記の濃度に希釈して用いる。
HECD-1の場合
 10μg/ml 室温30~60分、または、2μg/ml 4℃ 一晩
SHE78-7の場合
 2μg/ml 4℃ 一晩

反応後TBSですすぎ、TBSに浸漬   5分×3回

6.二次抗体反応(各社から様々なキットが販売されている)
標識二次抗体を使用する方法、ENVISION(DAKO社製)を使用する方法など
反応後TBSですすぎ、TBSで浸漬   5分×3回

7.発色(Peroxidaseの発色)
調製済みDAB基質溶液(DAKO、ニチレイ、シグマなど)を切片上に滴下する。
    5~15分
顕微鏡を覗いて反応停止
蒸留水で洗い流して蒸留水に浸漬

8.対比染色(核染色)
マイヤーのヘマトキシリン液に浸漬  1~5分
浸漬後、流水で洗浄脱色      10~15分

9.脱水・透徹
80%エタノール2~5分×1回
90%エタノール2~5分×1回
100%エタノール2~5分×2回
キシレン2~5分×3回

10.封入
マウントメディウムで封入する。
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