MiraCLEAN^® Endotoxin Removal Kit

（用意するもの）
0.5～1 mg/ml DNA サンプル in TE Buffer
エタノール（－20℃）
1.5 ml マイクロチューブ
50℃　恒温層　またはヒートブロック
微量高速遠心機
ボルテックスミキサー
氷

1. EndoGo Extraction Reagentを室温に戻す。使用前にvortexで攪拌する。
2. DNA サンプルを、TE Bufferまたは滅菌蒸留水で0.5～1.0 mg/mlに希釈する。
3. DNAサンプルの1/10 volumeのMiraCLEAN Bufferを加える。（例えば、DNAサンプルが100 μlのときは、10 μlのMiraCLEAN Bufferを加える。）
   ※サンプル量が多い場合は、1本のマイクロ遠心チューブに、1.2 ml以下になるようにサンプルを分注する。
   ※サンプル量が50 μl以下の場合は分離がむずかしくなるので、サンプルは50 μl以上を推奨する。
4. 少なくとも5分間氷中にチューブを置く。15分以上置いてはいけない。
5. チューブに0.03 volumeのEndoGO Extraction Reagentを加える。
   ※EndoGO Extraction Reagentは粘性が高くプラスチックに粘着するため、チューブの壁面につけず、DNAサンプル中に直接加えるようにしてください。
   ※EndoGO Extraction Reagentは少量をピペットでとるのはむずかしいため、先を切ったピペットのチップを用いて、ゆっくり目的の量をとってください。
6. チューブをvortexで攪拌後、氷中に5分間置く。（途中で2～3回vortexを行う。）
7. 50℃で5分間インキュベートする。
8. 室温で14,000×g以上で約20秒遠心する。
9. チューブをゆっくり遠心機から取り出す。注意深くチューブを傾けて、上層の透明な水層（DNAを含む）を、下層との境界面を壊さないように、ピペットを用いて注意深く 新しいチューブに移し、氷中に置く。エンドトキシンはピンク色の下層に含まれる。
10. 必要なら、5.～9.の操作を繰り返す。この操作を繰り返すことにより、エンドトキシンの除去率はあがるが、DNAの収率は1回の操作で約5～10%のロスは生じる。 2～3回の操作を繰り返すことにより、エンドトキシンを完全に（30 EU/mg以下）除去することが可能である。
11. DNAに2倍量の100％エタノール（－20℃）を加える。－20℃で一晩（またはさらに低温で30分以上）置く。
    14,000×gで4℃で20分遠心する。上清を除き、沈殿を70％エタノールで洗浄する。
    14,000×gで4℃で20分遠心する。上清を除き、沈殿を目的のバッファーで溶解する。