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Protocols

TRACP & ALP Assay Kit

Standard Protocol

■操作法
(1)96ウェルプレートで培養した接着細胞の場合
  1. 培養上清をアスピレーター等で除く。

  2. 生理食塩水を各ウェルに200 μlずつ加え、1回洗浄し、最終的に液を除去する。
     注)リン酸系の緩衝液は酵素反応を阻害する恐れがあるため、洗浄には生理食塩水を使用すること。
     注)細胞が剥離する場合はこの工程を省き、ブランク(培地のみの培養ウェル)を設定して、測定値を補正すること。


  3. 細胞抽出用溶液を各ウェルに5~50 μlずつ加え、軽くピペッティングする。
     注)加える抽出用液の液量は、細胞数により変更可能である。細胞数 104個の場合で50 μlを目安とすること。
     注)サンプル濃度が高い場合は細胞抽出用溶液で希釈すること。以後の反応には、希釈液の一部(5~50 μl)を使用すること。
     注)顕微鏡観察により細胞の可溶化の状況を確認する。

  4. 測定したい反応基質溶液を各ウェルに50 μlずつ加え、37℃で15~60分反応する。

  5. 0.5 N NaOHを各ウェルに50 μlずつ加え、呈色後、405 nmの吸光度を測定する。
     注)酸性ホスファターゼの場合、0.5 N NaOHを入れて初めて呈色する。

(2)シャーレ(ディッシュ)で培養した浮遊細胞の場合
  1. 浮遊細胞の培養液をチューブに集め、遠心して細胞を回収する。細胞を生理食塩水で1回洗浄したあと、再び遠心して細胞を沈殿させる。

  2. この細胞ペレットに細胞抽出用緩衝液を50~500 μl*加え、ピペッティングして細胞を可溶化する。
    * 加える抽出用液量は、細胞数により変更可能である。細胞数 105個の場合で50 μl、107個の場合で500 μlを目安とすること。

  3. 可溶化した細胞液を生理食塩水で段階希釈し、5~50 μlを添付の96ウェルプレートのウェルに加える。

    このステップ以降は、操作法(1)の4.~5.と同様。
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