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Protocols

TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set

PCR法によるマイコプラズマの検出

テストしたいサンプルがEagle等の通常の細胞培養用の培地を用いた培養上清の場合は、サンプルを直接PCRの反応系に加えマイコプラズマのDNAを増幅させることができる。しかし培地等の試料中にPCRの反応阻害物が含まれている恐れがあるときは、いったん試料よりDNAのみを抽出し、これを反応系に加える必要がある。
A.1st PCR
  1. 以下の手順で試薬を加えて混合し、反応液を準備する。
    10×PCR Buffer* 5 μl
    dNTP Mixture*(各2.5 mM) 4 μl
    MCGp F1 Primer 0.5 μl
    MCGp R1 Primer 0.5 μl
    TaKaRa Taq 0.25 μl
    滅菌精製水 34.75~39.5 μl
    * TaKaRa Taq(製品コード R001A/B/C)に添付

  2. A. -1. の反応液を混合する。
  3. 次にクロスコンタミネーションを起こさないように注意して、PCR反応液量が50 μlになるようにサンプル(5 μl以下)を直接反応系に加える。
  4. サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、PCRを行う。
    94℃、30 sec
       ↓
     
    94℃、30 sec
     
    30~35 cycles
    55℃、 2 min
    72℃、 1 min
B.2nd PCR
  1. 以下の手順で反応液を調製する。
    10 × PCR Buffer* 5 μl
    dNTP Mixture*(各2.5 mM) 4 μl
    MCGp F2 Primer 0.5 μl
    MCGp R2 Primer 0.5 μl
    TaKaRa Taq 0.25 μl
    滅菌精製水 39.25 μl
    *TaKaRa Taq(製品コード R001A/B/C)に添付

  2. B. -1. の反応液を混合する。
  3. 次にクロスコンタミネーションを起こさないよう注意して、1st PCRの反応産物を0.5 μl加える。
    鮮明なPCR産物を得るためには、1st PCRの反応産物原液の他に、10倍希釈、100倍希釈した反応産物を、それぞれ0.5 μl加えてPCRを行うとよい。
  4. サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、PCRを行う。
    94℃、30 sec
       ↓
     
    94℃、30 sec
     
    30 cycles
    55℃、 2 min
    72℃、 1 min
C.増幅産物の電気泳動による解析
  1. 反応終了後1st PCRおよび2nd PCRの反応産物より10 μlとり電気泳動用のサンプルとする。
  2. アガロースゲル電気泳動により増幅断片の有無、およびその大きさ*をチェックする。1st PCRの反応産物は、例えば1%アガロースゲル[Agarose L 03「TAKARA」(製品コード 5003)等]を用いて解析を行う。2nd PCRの反応産物は、2~4%のアガロースゲル[PrimeGel Agarose PCR-Sieve(製品コード 5810A)など]を用いて解析を行う。

    表2に12種のマイコプラズマのDNAをそれぞれ鋳型とし、2種のプライマー対を用いて増幅を行った場合の増幅断片の大きさを示している。
      F1 and R1(bp) F2 and R2(bp)
    M. hyopneumoniae 681 237
    M. neurolyticum 501 196
    M. fermentans 491 195
    M. pulmonis 477 189
    M. hyorhinis 448 211
    M. orale 423 179
    M. capricolum 415 179
    M. arthritidis 408 157
    M. salivarium 403 151
    M. hominis 370, 369 147, 148
    M. arginini 369 145
    U. urealyticum 482, 481 154
    表2. 12種類のマイコプラズマ属における増幅断片の大きさ
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