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Protocols

TaKaRa DNA Ligation Kit LONG

平滑末端の場合

平滑末端の場合
  1. 以下の反応液を混合する
    試薬使用量

    ベクターDNA *1X μl(50~100 ng)
    インサートDNA *1Y μl
    10× LONG Ligation Buffer5 μl
    dH2OZ μl

    Total45 μl

  2. 65℃で3分間保温後、氷上で3分間急冷する。
  3. DNA Ligase <LONG>を5 μl加えて、穏やかに攪拌する。
  4. 16℃で15時間保温する。
  5. 直ちに形質転換を行う場合は、100 μlのコンピテントセルに、4~10 μlの 反応液を加える。*2
    全量あるいは10 μlより多く加えたい場合は、バッファー置換後に加える。*2
*1 ベクターDNA およびインサートDNAは、TE Bufferなどに溶解してください。
ベクター(2~10 kb)濃度を1 ~ 2 ng/μlに設定して反応を行ってください。
インサートをベクターと等量程度の重量(ng)で使用することで良い結果が得られることが多いですが、最適なベクター:インサートのモル比はインサートの長さにより異なります。
ベクター:インサート= 1:2~10:1のモル比で条件を検討してください。
取扱説明書のIV. 注意事項1、3をご参照ください。

*2 ライゲーション反応液はそのまま形質転換に用いることが可能です。通常のケミカルコンピテントセルを用いた形質転換法により約20 kb(ベクター長+インサート長)までのライゲーション産物が形質転換可能であることを確認しています。20 kb以上の長鎖DNAの形質転換にはエレクトロポレーション法で行うことをお勧めします。エレクトロポレーション法を行うにはライゲーション反応液をエタノール沈殿法、または、透析法等を用いて滅菌水またはTEバッファーに置換してください。
フェノール/クロロホルムによる抽出は形質転換効率を下げる原因になるので避けてください。

コントロール反応
  1. 以下の反応液を混合する
    試薬使用量

    Control Vector (pUC118/Hind III/BAP) (25 ng/μl) 1 μl
    Control Insert DNA/Hind III (18 kbp) (25 ng/μl) 3 μl
    10× LONG Ligation Buffer5 μl
    dH2O40 μl

    Total49 μl

  2. 65℃で3分間保温後、氷上で3分間急冷する。
  3. DNA Ligase <LONG>を1 μl加えて、穏やかに攪拌する。
  4. 16℃で、3~15時間保温する。
  5. 上記反応液4 μlで、コンピテントセル100 μlを形質転換し、X-Gal、IPTGを含むL-ampプレート上でコロニーを形成する。
    1×108 cfu/ μgの形質転換効率を持つE. coli Competent Cells(DH5α、JM109、HST02など)を使用した場合、1×106 cfu/ μg vector以上のコロニーが得られる。
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