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Protocols

サルモネラ菌 (invA gene) One Shot PCR Kit

菌体熱抽出サンプルからの検出例
サルモネラ菌 (invA gene) One Shot PCR Kit(製品コード RR115A)

  1. 菌体熱抽出サンプルの調製

    1)増菌培養液4 μlを1.5 ml tubeに、または0.2 ml PCR tubeに採る。
    2)滅菌水を1.5 ml tubeの場合は196 μl、0.2 ml tubeの場合は98 μlを加えて混合する。
    3)95℃で5分間熱処理する。(0.2 ml PCR tubeの場合は サーマルサイクラーを利用すると簡便に行うことができる。)
    4)遠心分離(12,000 rpm、4℃、10分)し上清を回収する。これを熱抽出サンプルとする。
    * 増菌培養液は、それぞれ適当な標準プロトコールに従って食品サンプルから調製したものを用いる。また、熱抽出サンプルは-20℃で保存可能である。
  2. PCR 反応液調製・反応
    正しい検出結果を得るために Negative control反応を行ってください。
    1)2×One Shot PCR solution tubeに調製した熱抽出サンプルを25 μl添加する。
    Negative control として滅菌水を25 μl加えたものを1本用意する。
    2)各チューブのキャップをしっかり閉め、サーマルサイクラーにセットして PCR反応を開始する。
    【PCR条件】
    94℃1 min.
     
    35 cycles
    55℃1 min.
    72℃1 min.
    72℃10 min. 

     ・反応は約2.5時間で終了する。反応後のサンプルは4℃、または-20℃で保存可能である。

  3. 判定
    サンプル中にinvA遺伝子が存在すれば、378 bpの増幅産物(バンド)が検出される。
    インターナルコントロールは、1,073 bpの増幅産物が検出される。
    サンプル反応の結果は、Negative control反応結果と照らし合わせて判定してください。

    [ Negative control 反応の電気泳動結果 ]


    インターナルコントロール由来増幅産物(1,073 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(1,073 bp)が検出された。
    invA遺伝子由来増幅産物(378 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1 【4】 コンタミネーションを起こさず、正しくPCR反応が進んだ。 【3】
    invA遺伝子由来増幅産物(378 bp)が検出された。 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【2】 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【1】

    [ サンプル反応の電気泳動結果 ]


    インターナルコントロール由来増幅産物(1,073 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(1,073 bp)が検出された。
    invA遺伝子由来増幅産物(378 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1 【4】 invA遺伝子は検出限界以下である。 【3】
    invA遺伝子由来増幅産物(378 bp)が検出された。 invA遺伝子陽性である。*3 【2】 invA遺伝子陽性である。*3 【1】

    【1】~【4】は、下図のレーンをご参照ください。

    *1 何らかの原因でPCR反応が正常に行われていない可能性が高いので再反応を行う。
    *2 コンタミネーションを起こしていると考えられる。反応液調製場所及び使用した機器を除染したうえですべてのサンプルで再度反応を行う。
    *3 Negative control反応で正しい結果(レーン3)が得られた場合にinvA遺伝子陽性と判定される。
    サンプル反応の電気泳動結果


94℃2 min. 
94℃30 sec.
 
40 cycles
55℃1 min.
72℃1 min.

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