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Protocols

TB Green® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)

Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR System を用いる場合の操作方法

TB Green Premix DimerEraser(Perfect Real Time)(製品コード RR091A/B)

※ 各機種の取扱説明書に従って操作してください。
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    TB Green Premix DimerEraser(2×)10 μl25 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.6 μl1.5 μl0.3 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.6 μl1.5 μl0.3 μM*1
    ROX Reference Dye(50×)or Dye II(50×)*20.4 μl1 μl
    template(<100 ng)2 μl4 μl    *3
    滅菌精製水6.4 μl17 μl 
    Total20 μl*450 μl*4 

    *1 最終primer濃度は0.3 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合にはROX Reference Dye II(50×)を、StepOnePlusにはROX Reference Dye(50×)を使用する。

    *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。

    *4 各装置の推奨容量に従って調製する。

  2. 反応を開始する。
    PCRは、下記の3 step PCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    反応性に問題がある場合には、下記の「PCR反応条件について」を参考に最適なPCR条件を検討してください。

    <Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>
    3 step PCR 標準プロトコール

      3 step PCR 標準プロトコール
      Stage 1:初期変性
        Reps:1
        95℃ 30秒
      Stage 2:PCR反応
        Reps:40
        95℃ 5秒
        55℃ 30秒
        72℃ 30秒 or 34秒
      Melt Curve Stage

       StepOnePlusでは30秒に、7500では34秒に設定する。

    <Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>

       3 step PCR 標準プロトコール
       Holding Stage
         Number of Cycles:1
         95℃ 30秒
       Cycling Stage
         Number of Cycles:40
         95℃ 3秒
         55℃ 30秒
         72℃ 30秒
       Melt Curve Stage

  3. ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

  4. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について

初期変性

初期変性は通常95℃、30秒で充分です。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でも、ほとんどの場合、この条件で良好に反応できます。鋳型の状態によっては、95℃、1~2分程度に延長することが可能ですが、時間が長すぎると酵素の失活を招く恐れがありますので、2分以上の条件は推奨しません。

PCR 条件と反応特異性

反応特異性を上げるには、アニーリング温度を上げるか2 step PCRに変更します。特に高分子側の非特異的増幅が見られる(融解曲線分析で目的のターゲットより高いTm値のピークが見られる)場合には、2 step PCRへの変更が有効です。

[ 3 step PCR ]
95℃ 5秒

*1
55℃ 30秒

72℃ 30秒 ~34秒 *2

アニーリング温度を上げる

95℃ 5秒
*1
~60℃ 30秒

72℃ 30秒 ~34秒 *2

[ 2 step PCR ]

95℃ 5秒
*1
60℃ 30秒 ~34秒 *2

アニーリング温度を
上げる

95℃ 5秒
*1

64℃ 30秒 ~34秒 *2

*1 7500 Fastでは3秒に設定する。
*2 7000では31秒、7500では34秒、7500 Fastでは30秒に設定する。

PCR条件と増幅効率

増幅効率を上げるには、伸長反応時間を延ばします。

[ 3 step PCR ]


95℃ 5秒
*1

55℃ 30秒

72℃ 30秒 ~34秒 *2

伸長時間を延ばす

95℃ 5秒
*1

55℃ 30秒
72℃ 1分

*1 7500 Fastでは3秒に設定する。
*2 7000では31秒、7500では34秒、7500 Fastでは30秒に設定する。
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