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QuickPrimer (Real Time)シリーズ

反応液の調製

QuickPrimer (Real Time)シリーズ(製品コード MR101~113、MR201~205、MR207、MR208)

QuickPrimer (Real Time)シリーズ(製品コード MR101~113、MR201~205、MR207、MR208)

本製品を用いた各サンプルの反応は、必ず陽性コントロールDNA(10倍希釈液;用時調製)での反応および陰性コントロール反応と一緒に行ってください。各サンプルより得られたTm値が、同時に反応を行った陽性コントロールDNA(10倍希釈液)より得られたTm値±1.5℃の範囲(判定基準Tm値)に含まれるかどうかにより判定を行います。
精製DNA以外のサンプル(熱抽出サンプルなど)では、不純物の影響により、Tm値が判定基準Tm値に納まらない場合があります。そのような影響の有無を確認するためには、陽性コントロールDNA反応液にサンプルを加えて得られたTm値と、陽性コントロールDNAのみの反応で得られたTm値とを比較することをお勧めします。また、サンプルの精製度が低い場合やサンプル中のDNA量が多すぎる場合には、PCR反応が正常に行われず、偽陰性となる場合がありますのでご注意ください。

(1)反応液の調製(エリア 1 で実施)

下記に示す反応液を氷上で調製する。
サンプル以外のコンポーネントを必要本数+αを調製し、アルミプレートにセットした反応チューブに17 μlずつ分注し軽く蓋をする。必要本数は、サンプル数+2本(陽性コントロールDNA(10倍希釈液:用時調製)、陰性コントロールとして滅菌精製水を加えたもの)と設定する。

【Thermal Cycler Dice Real Time Systemの場合】
<1反応あたり>
試薬名液量(1反応)最終濃度
TB Green Premix Ex Taq(2×)*110 μl
Primer Mix(5×)4 μl
サンプルor 陽性コントロールDNA(10倍希釈液)*2, 3 or滅菌精製水 (3 μl)*4
滅菌精製水up to 20 μl 

【Applied BiosystemsのリアルタイムPCR装置の場合】
<1反応あたり>
試薬名液量(1反応)最終濃度
TB Green Premix Ex Taq(2×)*110 μl
Primer Mix(5×)4 μl
サンプルor 陽性コントロールDNA(10倍希釈液)*2, 3 or滅菌精製水(3 μl) *4
ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II*50.4 μl 
滅菌精製水up to 20 μl 
*1 反応に必要なバッファー、dNTP Mixture、酵素およびTB Greenを含みますので、 激しい撹拌はおこなわないようご注意ください。
*2 陽性コントロールDNAは、プライマーに対応したQuickPrimer (Real Time)シリーズ用Positive Control DNA (QuickPrimer Control DNA 1~15)をご使用ください。陽性コントロールDNAをリアルタイムPCRコンポーネントに誤って混入すると、 正しい検出反応ができません。コンタミネーション防止のため、取り扱いには十分ご注意ください。
*3 陽性コントロールDNAは使用時に下記のように滅菌精製水で10倍希釈し、 このうち3 μlを反応系に添加してください。残った希釈液は保存せずに廃棄してください。
<10倍希釈液の調製方法>
QuickPrimer Control DNA3 μl
滅菌精製水27 μl
Total30 μl
*4 サンプル等の鋳型は、この段階では加えないでください。サンプル(鋳型)は、1~3 μlの範囲で変更が可能です。 最終反応液量が20 μlになるように滅菌精製水量を加減してください。
*5 StepOne PlusにはROX Reference Dyeを、7500、7500 FastReal-Time PCR SystemにはROX Reference Dye IIを ご利用ください。ROX Reference Dye/Dye IIは、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR420S/A/B)に含まれています。 Thermal Cycler Dice Real Time Systemを用いる場合は、ROX Reference Dyeの添加は不要です。

(2)滅菌精製水の添加

エリア3において(1)で反応液を分注したチューブの蓋をあけ、1本に陰性コントロール用としてサンプルの代わりに滅菌精製水を3 μl添加し、 しっかりと蓋をする。
エリア3に移動する。

(3)サンプルの添加(エリア3で実施)

(1)で反応液を分注した残りのチューブについて、サンプルまたは陽性コントロールDNA(10倍希釈液)を添加し、しっかりと蓋をする。
【注意】
蛍光ノイズの原因になりますので、チューブや蓋には素手で触れないようにしてください。

(4)反応チューブのセット

1)反応チューブを卓上遠心機で軽く遠心して、反応液をチューブの底に落とし、底部の気泡等を取り除く。
2)使用するチューブ数が少ない場合は、リアルタイム PCR装置の中央付近にセットし、端の列に空のチューブをセットする。
   【注意】 反応液調製後、なるべく 30分以内に反応を開始してください。

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