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Protocols

MightyAmp™ for Real Time (TB Green® Plus)

Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

MightyAmp for Real Time (TB Green Plus)(製品コード R075A/B)
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
  1. 各装置が推奨する反応液量に基づき、下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    MightyAmp for Real Time(TB Green Plus)(2×)10 μl25 μl
    PCR Forward Primer (10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer (10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    ROX Reference Dye (50×) or Dye II (50×)*30.4 μl1 μl
    template2 μl4 μl*2
    滅菌水6.8 μl18 μl 
    Total20 μl*450 μl*4 
    *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
    *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。
    *3 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度が低く設定されている。 7500および7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析を行う場合には、ROX Reference Dye II (50×)の使用を推奨する。
    StepOnePlusには、ROX Reference Dye (50×)を使用する。
    *4 96ウェルプレート、シングルチューブおよび8連チューブでの反応は50 μl反応系で行う。384ウェルプレート、Fast System用の96ウェルプレート、8連チューブ(0.1 ml)での反応は20 μl反応系で行う。
  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記の標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。PCR条件を至適化する場合は、「PCR条件について」を参照してください。

    <Applied Biosystems 7000、7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>

    標準プロトコール

      Stage 1 :初期変性
        Reps:1
        98℃ 2分

      Stage 2 :PCR反応
    Reps:40
    98℃ 10秒
    60℃ 15秒
    68℃ 1分/kb
        (500 bp以下は30秒)

      Dissociation Stage

    <7500 Fast Real-Time PCR System>

    7500 Fast Real-Time PCR System
    標準プロトコール
      Stage 1 :初期変性
      Reps:1
      98℃ 2分
    Stage 2 :PCR反応
      Reps:40
      98℃ 10秒
      60℃ 15秒
      68℃ 1分/kb
        (500 bp以下は30秒)
      Melt Curve Stage

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているMightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、各装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について

【PCR条件の検討】
○反応特異性を上げるには
アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら、検討してください。
標準プロトコール
98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃1分/kb

アニーリング温度を上げる
98℃2分 
98℃10秒
 
~64℃15秒
68℃1分/kb

シャトルPCRにする

98℃2分 
98℃10秒
 
68℃1分/kb

○増幅効率を上げるには
伸長時間を延ばすか、アニーリング温度を下げることにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討してください。
標準プロトコール

98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃1分/kb

伸長時間を延ばす

98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃~2分/kb

アニーリング温度を下げる

98℃2分 
98℃10秒
 
55℃15秒
68℃~1分/kb

伸長時間を延ばす

98℃2分 
98℃10秒
 
55℃15秒
68℃~2分/kb
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