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Protocols

MightyAmp™ for Real Time (TB Green® Plus)

LightCycler®を用いる場合の操作方法

MightyAmp for Real Time (TB Green Plus)(製品コード R075A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    MightyAmp for Real Time(TB Green Plus)(2×)10 μl
    PCR Forward Primer (10 μM)0.4 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer (10 μM)0.4 μl0.2 μM*1
    template (<100 ng)2 μl*2
    滅菌水7.2 μl 
    Total20 μl 

    *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。



  2. 反応を開始する。
    PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
    * PCR反応は、下記の標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化する。PCR条件を至適化する場合は下記の「PCR条件について」を参照してください。

    標準プロトコール
     標準プロトコール

      Stage 1:初期変性
        98℃  2分  20℃/秒
        1サイクル

      Stage 2:PCR反応
        98℃  10秒  20℃/秒
        60℃  15秒  20℃/秒
        68℃  1分/kb 20℃/秒
              (500 bp以下は30秒)
        40サイクル

      Stage 3:融解曲線分析
        95℃   0秒 20℃/秒
        65℃  15秒 20℃/秒
        95℃   0秒 0.1℃/秒


    ※使用上の注意
    本製品に使用しているMightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について

【PCR条件の検討】
○反応特異性を上げるには
アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら、検討してください。
標準プロトコール
98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃1分/kb

アニーリング温度を上げる
98℃2分 
98℃10秒
 
~64℃15秒
68℃1分/kb

シャトルPCRにする

98℃2分 
98℃10秒
 
68℃1分/kb

○増幅効率を上げるには
伸長時間を延ばすか、アニーリング温度を下げることにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討してください。
標準プロトコール
98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃1分/kb

伸長時間を延ばす
98℃2分 
98℃10秒
 
60℃15秒
68℃~2分/kb

アニーリング温度を下げる
98℃2分 
98℃10秒
 
55℃15秒
68℃~1分/kb

伸長時間を延ばす
98℃2分 
98℃10秒
 
55℃15秒
68℃~2分/kb
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