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ゲノムDNA抽出~断片化~メチル化DNA濃縮の操作例
(EpiXplore™ Methylated DNA Enrichment Kit)

1) ゲノムDNAの抽出
NucleoSpin Tissue(製品コード 740952.50)
EpiXplore Methylated DNA Enrichment Kitによる1回の濃縮操作*1で、約1 μgのゲノムDNAを処理できる。
*1 10 ng~1 μgで処理可能
2) ゲノムDNAの断片化
ゲノムDNAの断片化には、塩基配列特異的なバイアスを生じる制限酵素処理による切断は避け、超音波などによる物理的な切断方法を利用するのが望ましい。市販の様々な超音波破砕装置がDNAの断片化に利用できる。以下プロトコールでは、一例として、超音波発生プローブを利用した超音波発生装置(例:トミー精工 UD-201, 200, UR-20P)によるDNA断片化方法を紹介する。
  1. ゲノムDNA(2~10 μg程度)をTE 300 μl に溶解する。
  2. 超音波破砕機を用いて適当なサイズ(200~800 bp)に断片化する。
    ・超音波破砕の条件は、予備実験により決めておく。
    ・超音波破砕は、温度上昇を防ぐため、チューブを氷上に立てて行う。
  3. アガロース電気泳動やAgilent 2100 Bioanalyzerにより断片化したDNAのサイズを確認する。
  4. 断片化DNAをエタノール沈殿により濃縮し、滅菌水に溶解する。DNAの濃度を測定し、必要に応じて適当な濃度に調整する。
3) EpiXplore Methylated DNA Enrichment Kitによるメチル化DNAの濃縮
(操作方法の詳細を本キットのユーザーマニュアルでご確認の上、ご使用ください。)

【キット以外に必要なもの】
・磁気ビーズ分離用マグネティックセパレータースタンド
・1.5 mlマイクロチューブ(ヌクレアーゼフリーのもの)
・3 M Sodium acetate, pH 5.2
・96-100% Ethanol
・(冷)70% Ethanol

  1. TALON磁気ビーズの洗浄
    TALON磁気ビーズをvortexで穏やかに懸濁し、1.5 mlマイクロチューブに100 μlを分注する。マグネティックセパレータースタンドを利用して1×Binding/Wash Buffer 100 μlで2回洗浄後、1×Binding/Wash Buffer 100 μlに懸濁する。
  2. MBD2とTALON磁気ビーズの結合
    1. 洗浄済みビーズに希釈したMBD2タンパク質(MBD2 10 μl + 1×Binding/Wash Buffer 90 μl)を添加する。
    2. 室温で1時間、ローテーターで混合する。
    3. マグネティックセパレータースタンドでMBD2/TALON磁気ビーズを分離し、上清を除いた後、MBD2/TALON磁気ビーズを1×Binding/Wash Buffer 100 μlで3回洗浄し、上清を除く。
  3. メチル化DNAとMBD2の結合
    1. 25 μlの4×Binding/Wash Bufferに断片化したゲノムDNA 約1 μgを加え、ヌクレアーゼフリー水で100 μlに調整する。
    2. MBD2/TALON磁気ビーズにaで調製した断片化DNAを添加する。
    3. 室温で1時間、ローテーターで混合する。
    4. マグネティックセパレータースタンドで分離し、上清を新しいチューブに回収する【非結合画分】。
    5. DNA/MBD2/TALON磁気ビーズを1×Binding/Wash Buffer 200 μlで2回洗浄する。
  4. メチル化DNAの溶出
    1. DNA/MBD2/TALON磁気ビーズを200 μlのElution Buffer (High)に懸濁する。
    2. マグネティックセパレータースタンドで分離し、上清を新しい1.5 mlチューブに回収する【結合画分(溶出画分)】。
    3. a~bのステップをもう一回繰り返す。
    <注意> 塩濃度の異なる3種類のElution BufferをLow、Middle、Highの順に使用すると、CpGメチル化密度に応じメチル化DNAを分画できます。分画の必要がない場合は、Elution Buffer (High)だけを使用してください。
  5. エタノール沈殿
    1. 各回収画分に3 M Sodium acetate, pH 5.2とDr.GenTLE Precipitation Carrier(Genとるくんエタ沈キャリア)を添加して、エタノール沈殿を行う。
    2. 冷70%エタノールでリンスする。
    3. 沈殿を乾燥させ、適当量(20~60 μl)のTEやヌクレアーゼフリー水に溶解する。
    <注意> 溶出に使用するElution Bufferは塩濃度が高いため、エタノール沈殿後のDNAに塩が残存する場合があります。下流のアプリケーションによっては、必要に応じて脱塩操作を行ってください。
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