TB Green^® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)

＜1反応あたり＞

試薬	使用量		使用量		最終濃度
TB Green Premix Ex Taq（2×）	10 μl		25 μl		1×
PCR Forward Primer（10 μM）	0.4 μl		1 μl		0.2 μM	*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.4 μl		1 μl		0.2 μM	*1
ROX Reference Dye（50×）or Dye II（50×）*2	0.4 μl		1 μl		1×
template（＜100 ng）*3	2 μl		4 μl
滅菌精製水	6.8 μl		18 μl
total	20 μl	*4	50 μl	*4

*1	最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2	ROX Reference Dye II（50×）は、ROX Reference Dye（50×）より濃度が低く設定されている。Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systemおよび7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II（50×）を使用する。 StepOnePlusおよび7900HT/7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye（50×）を使用する。
*3	template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10％以下とする。
*4	各装置の推奨容量に従って調製する。

PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。（PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。）

＜Applied Biosystems 7900HT/7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞

*	7900HTおよびStepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。

＜Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System＞

シャトルPCR標準プロトコール

Holding Stage

Reps：1

95℃、30秒

Cycling Stage

Number of Cycles：40

95℃、3秒

60℃、30秒

Melt Curve Stage

※使用上の注意 本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。 PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。