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Protocols

TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)

Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus™ Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR820A/B)
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μl 25 μl   
    PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μl 2 μl  0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl 2 μl  0.4 μM*1
    Rox Reference Dye(50×) or Dye II(50×)*20.4 μl  1 μl  
    template(<100 ng)*32μl 4 μl    
    滅菌精製水6μl 16 μl   
    total25 μl*450 μl*4  

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは 0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 ROX Reference Dye II(50×)は、ROX Reference Dye(50×)より濃度を低く設定している。 Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II(50×)を使用する。
    StepOnePlusおよび7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye(50×)を使用する。

    *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。 20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、 添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。

    *4 各装置の推奨容量に従って調製する。


  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。 (PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」 をご参照ください。)

    <Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>
    シャトルPCR標準プロトコール

    シャトルPCR標準プロトコール
    Stage 1:初期変性
    Reps:1
    95℃、30秒

    Stage 2:PCR反応
    Reps:40
    95℃、5秒
    60℃、30秒~34秒*

    Dissociation Stage

    StepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。

    <Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>

    シャトルPCR標準プロトコール
    Holding Stage
    Reps:1
    95℃、30秒

    Cycling Stage
    Number of Cycles:40
    95℃、3秒
    60℃、30秒

    Melt Curve Stage

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。 他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。 必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
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