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Protocols

TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)

LightCycler®を用いる場合の操作方法

TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)(製品コード RR820A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μl  
    PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μl 0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl 0.4 μM*1
    template(<100 ng)*22 μl 
    滅菌精製水6.4 μl  
    total20 μl  

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは 0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。 段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして 添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。


  2. PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。(PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。)

    シャトルPCR標準プロトコール
    シャトルPCR標準プロトコール
    Stage 1:初期変性
    95℃、30秒  20℃/秒
    1サイクル
    Stage 2:PCR反応
    95℃、5秒  20℃/秒
    60℃、20秒  20℃/秒
    40サイクル
    Stage 3:融解曲線分析 95℃、0秒  20℃/秒
    65℃、15秒  20℃/秒
    95℃、0秒  0.1℃/秒

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。 他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。 必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
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