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トランスフェクショングレードプラスミド精製プロトコール(NucleoBond Xtra Midi)

NucleoBond Xtra Midi(製品コード 740410.10、740410.50、740410.100)
1培養液の調製
集菌
培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。
 培養液の液量(V)=400/ OD600 (ml) *1
培養液を、4℃、4,500~6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
2菌の溶解細胞ペレットを、Buffer RES(+RNase A)*2 8 ml*3 に完全に溶解する。
Buffer LYS 8 ml*3 を細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
室温で、5分間静置する。
3カラムの平衡化
カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU 12 mlで平衡化する。
図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。
フィルター全体が湿っていることを確認する。
4中和Buffer NEU 8 ml*3 を、2の細胞懸濁液に加え、直ちに穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
5ライセートの清澄化とローディング4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。
液を自然落下させてカラムを空にする。
6カラムの洗浄(1回目)
Buffer EQU 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。
図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
7カラムフィルターの廃棄
カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
8カラムの洗浄(2回目)
Wash Buffer WASH 8 mlで、カラムを洗浄する。
9溶出Elution Buffer ELU*4 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。
溶出液を15 ml遠心チューブ(各自で用意)に集める。
10沈殿イソプロパノール(室温)を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。
5,000×g以上で15分以上室温以下(好ましくは15,000×gで30分間、4℃)で遠心する。
上清を注意深く除去する。
11DNAペレットの洗浄と乾燥70%エタノール(室温)2 mlを沈殿に加え、5,000×g(好ましくは15,000×g)以上で5分間、室温で遠心する。
エタノールをチューブから完全に除去する。
5~10分間乾燥する。(乾燥しすぎるとDNAが溶解しにくくなるので注意する。)
12DNAの溶解適量のTE Bufferまたは滅菌蒸留水で溶解する。

*1 低コピープラスミドの場合は、培養液の液量(V)=800/ OD600 (ml)
*2 Buffer RES(+RNase A)の調製法
RNase A(凍結乾燥品)のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
*3 低コピープラスミドの場合は、16 ml
*4 BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。
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