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Protocols

Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)

Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific社)を用いる場合の反応プロトコール

  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    < 1反応あたり >
    試薬使用量使用量最終濃度
    Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2×conc.)10 μl 25 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    プローブ0.8 μl2 μl*2
    ROX Reference Dye II(50×)*3 0.2 μl0.5 μl0.5×
    template2 μl4 μl*4
    滅菌精製水6.2 μl16.5 μl 
    Total20 μl*550 μl*5 

    *1最終プライマー濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
    *2プローブ濃度は、使用するリアルタイムPCR装置の機種やプローブの蛍光標識物質により異なる。装置の取扱い説明書やプローブの添付データシートを参考に添加量を検討する。
    *3ROX Reference Dye II(50×) は最終濃度0.5×で使用する。
    *4template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。
    *5各装置の推奨容量に従って調整する。


  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めする。まず、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。(「PCR反応条件について」を参照。)

    <7500 Real-Time PCR System>


     シャトルPCR標準プロトコール

      Stage 1 :初期変性
        Reps:1
        95℃ 30秒
      Stage 2 :PCR反応
        Reps:40
        95℃  5秒
        60℃ 34秒




    <7500 Fast Real-Time PCR System>


     Fastプロトコール

      Holding Stage
        Reps:1
        95℃ 20秒
      Cycling Stage
        Number of Cycles:40
        95℃  3秒
        60℃ 30秒


  3. 反応終了後、解析を行う。
    反応終了後、増幅曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    * 解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

<PCR反応条件について>

初期変性

ステップ 温度 時間 検出 コメント
初期変性95℃30秒OFF初期変性は通常95℃、30秒で十分である。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でもこの条件で良好に反応できることが多い。鋳型の状態によっては、95℃、1~2分程度に延長することが可能だが、時間が長すぎると酵素の失活をまねく怖れがあるので、2分以上の条件は推奨しない。

シャトルPCR

ステップ 温度 時間 検出 コメント
変性95℃3~5秒OFFリアルタイムPCRの増幅サイズは一般的に300 bp以下なので、95℃で3~5秒程度でよい。
アニーリング/伸長56~64℃30~34秒*6ON まずは各々の標準プロトコールを試す。反応条件の至適化を行う場合には、56℃~64℃の範囲で検討する。反応性が悪い時は、このステップの時間を延ばすと改善する場合がある。

サイクル数:30~45サイクル

*6 Applied Biosystems 7500 は34秒以上に、7500 Fast は30秒以上に設定する。
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