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Protocols

NucleoSpin® RNA XS

培養細胞・組織からのRNA抽出プロトコール

NucleoSpin® RNA XS(製品コード 740902.10/740902.50/740902.250)
1.試薬の準備

TCEP*1,Carrier RNA溶液*2,rDNase溶液*4,Buffer RA3*5が添付のprotocolに従って調製、希釈されていることを確認する。
2. サンプルの準備
組織:5 mgの組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、またはホモジナイザー処理などで細分化処理を行う。
細胞:1×105個の培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。
3. サンプルの溶解
Buffer RA1 200 μl(組織の場合)または100 μl(細胞の場合)にTCEP*1 4 μl(組織の場合)または2 μl(細胞の場合)を添加した溶液を、組織または細胞に添加し、vortexを行い(5秒間×2回)、均一にホモジナイズする。
4. キャリアRNAの添加

Carrier RNA希釈溶液*2 5 μlを添加する。vortexを行い(5秒間×2回)、スピンダウンする。
5. ライセートのろ過
    (オプション)
NucleoSpin Filter(紫のリング)をCollection Tube(2 ml)にセットする。
4のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、30秒間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く。*3
サンプルが少量の細胞の場合は、この操作は除いてもよい。
6. エタノールの添加

ろ液に70%エタノール200 μl(組織の場合)または100 μl(細胞の場合)を添加し、よく混合する。
7. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA XS Column(水色のリング)を用意する。
6の溶液をカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(2 ml)にセットする。
8. メンブレンの脱塩
MDB 100 μlをカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
9. DNase処理
rDNase溶液*4 3 μlとReaction Buffer for rDNase 27 μlを混合し、DNase reaction mixtureを調製する。
DNase reaction mixture 25 μlをシリカメンブレンの中央へ直接添加し、室温(18~25℃)で15分間インキュベートする。
10. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer RA2 100 μlをカラムに添加し、室温で2分間インキュベートした後、11,000×gで30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(2 ml)にセットする。
2回目の洗浄
Buffer RA3*5 400 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、再び同じCollection Tubeにセットする。
3回目の洗浄
Buffer RA3*5 200 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(1.5 ml)にセットする。
11. RNAの溶出
RNase-free H2O 10 μlをカラムに加え、11,000×gで30秒間遠心する。
溶出したRNA溶液は、-20℃または-70℃で保存する。

*1 TCEP
製品コード 740902.10(10回用)の場合:TCEP 1 vial(14 mg)にRNase free H20 100 μlを加え、室温で数分インキュベートし、完全に溶解する。調製したTCEP溶液は、-20℃で保存する。

*2 Carrier RNA溶液
ストック溶液:Carrier RNA 1 vial(300 μg)にBuffer RA1 750 μlを添加し、400 ng/μlの溶液を調製する。 -20℃で保存する。
希釈溶液:ストック溶液を、Buffer RA1で100倍希釈する。(例:Carrier RNAストック溶液 1 μl + Buffer RA1 99 μl) 希釈溶液は使用直前に調製する。保存不可。

*3 ろ液に沈殿が見られた場合は、上清を別のチューブに移してから70%エタノールを添加する。

*4 rDNase溶液
製品コード 740902.10(10回用)の場合:rDNase 1 vial にRNase free H20 55 μlを加え、室温で1分インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、-20℃に保存する。(6ヵ月間安定)

*5 Buffer RA3
製品コード 740902.10(10回用)の場合:Wash Buffer RA3(Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール  24 mlを添加する。

注意
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書を確認すること。

*1*2*4*5は製品コード740902.10(10回用)の場合の調製法である。
製品コード、740902.50(50回用),740902.250(250回用)の場合の調製法は英文説明書を参照すること。
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