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培養細胞・動物組織からのDNA抽出プロトコール(NucleoSpin® Tissue)

NucleoSpin Tissue(製品コード740952.10, 740952.50, 740952.250)
 動物組織細胞
1. サンプルの準備

25 mgの組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、またはホモジナイザー処理などで細分化を行う。
107個の培養細胞をBuffer T1 200 μlに懸濁する。Proteinase K溶液*1 25 μl、Buffer B3 200 μlを加え、70℃で10~15分間インキュベートする。
(オプション) RNase処理を行う場合:107個の培養細胞を Buffer T1 200 μlに懸濁する。Proteinase K 25 μlを添加し、室温で10分間インキュベートする。Proteinase K処理後、RNase A(20 mg/ml)溶液(各自で用意)*2 20 μlを加え、室温で5分インキュベートする。Buffer B3*3 200 μlを加え、70℃で10~15分間インキュベートする。
2. Proteinase K処理
Buffer T1 180 μl、Proteinase K溶液*1 25 μlを組織に添加し、激しく攪拌する。56℃で1~3時間(または一晩)完全に溶解するまでインキュベートする。
(オプション) RNase処理を行う場合:Proteinase K処理後、RNase A(20 mg/ml)溶液(各自で用意)*2 20 μlを加え、室温で5分インキュベートする。
3. サンプルの溶解
サンプルを撹拌する。Buffer B3*3 200 μlを加えて、激しく撹拌した後、70℃で10分間インキュベートする。
不溶物が残る場合は、11,000×g、5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。
4. エタノールの添加
96~100%エタノール 210 μlを添加し、よく混合する。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin Tissue ColumnをCollection Tubeにセットする。
4の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、新しいCollection Tubeにカラムをセットする。
6. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer BW 500 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeをカラムにセットする。
2回目の洗浄
Buffer B5*4 600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
7. メンブレンの乾燥

カラムを、11,000×gで1分間遠心する。
8. DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
70℃に温めたBuffer BE*5 100 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、-20℃で保存する。(凍結融解はできるだけ繰り返さない)
*5 Buffer BEの組成:5 mM Tris-HCl、pH8.5

*1 Proteinase K溶液の調製法
製品コード 740952.10の場合:Proteinase K(凍結乾燥品)6 mgのチューブにProteinase Buffer PB 260 μlを加えて完全に溶解する。
調製したProteinase K溶液は、-20℃で保存する。(6ヵ月月安定)
*2 RNase A溶液(製品コード 740505.50、50 mg)の調製法
RNase A 1 vialにRNase free H2O 2.5 mlを加え溶解して、RNase A溶液(20 mg/ml)を調製する。
調製したRNase A溶液は、3ヵ月までは4℃で保存可能。長期の保存の場合は、小分けして-20℃で保存する。
*3 Lot.1210/***以前のロットの場合、Buffer B3は各自で調製する。
Buffer B3の調製法
Buffer B1を全量Buffer B2のボトルに移し、よく混合する。混合後、ボトルにLysis Buffer B3のラベルを貼る。
*4 Buffer B5の調製法
製品コード 740952.10の場合:Wash Buffer B5(concentrate)4 mlに、エタノール(96~100%)16 mlを添加する。
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