この画面を閉じる
●Control Test Kit (Viable Bacteria Selection) の利用
Viable Bacteria Selection Kit for PCRシリーズの試薬コンポーネントには反応確認用のプラスミドDNAがあらかじめ混合されており、検体に対するEMA処理が正しく行われると、このプラスミドDNAも同時に修飾され、PCR増幅できない状態になる。Control Test Kit (Viable Bacteria Selection) を用いて、このプラスミドDNA上の領域をターゲットとするqPCR/PCR増幅を行うことで、検体成分などによるEMA処理の阻害が起こらなかったかどうかを確認できる。

比較のため、同一検体についてEMA処理ありサンプル、EMA処理なしサンプルをそれぞれ用意し、以下のように解析することを推奨する。
EMA処理使用する検出キット目的
あり対象菌のターゲット遺伝子を検出する適切なqPCR/PCR 検出系生菌由来DNA を検出
Control Test Kit (Viable Bacteria Selection)検体由来成分によるEMA処理反応阻害の有無を確認
なし対象菌のターゲット遺伝子を検出する適切なqPCR/PCR検出系死菌および生菌由来DNAを検出
A.サンプル調製
PCRによる検出は非常に高感度なため、実験環境や使用器具の汚染には極力注意を払い、コンタミネーション防止を心がける。
例)可能な限り、使い捨て器具を使用する。
使い捨てにできないものは、洗浄後、乾熱滅菌処理を施す。
マイクロピペットは用途別に準備する(本キットを用いた検体EMA処理及びDNA抽出用とPCR試薬調製用を分ける)。

【サンプル調製】
検出目的の菌種に適した方法でサンプル調製を行い、最終的に100 μl程度の菌懸濁液を用意する。このサンプル液のうち40 μlを「B. サンプルのEMA処理」に使用する。残りは氷上もしくは4℃で保存し、EMA処理なしサンプルを用意するために40 μlを「C. NucleoSpin Tissue XSを用いたDNA 抽出」に使用する。
なお、菌液に不純物が多く含まれるとEMA処理で光照射が不十分になることがあるため、サンプル調製の際にはできる限り不純物を除去する。
B. サンプルのEMA処理
*光照射装置 [LED Crosslinker 12(製品コード EM200)、LED Crosslinker]を使用する場合

条件検討により最適化した「氷上静置時間」と「処理回数」でEMA処理を行う。

【EMA処理操作】
  1. 1.5 mlチューブ(もしくは0.2 mlチューブ)にA.で調製したサンプル液40 μlを準備する。
  2. Solution A-gn 10 μlを添加し、混合*1 後、軽くスピンダウンする。
  3. Solution B-gn 5 μlを添加し、混合*1 後、軽くスピンダウンする。
  4. 遮光して氷上で5(~15)分間静置する。*2
  5. 光照射装置にセットし、光照射する。*3
  6. (照射時間の例)
    EMA 処理を1回のみ行う場合:15分間光照射する。
    EMA処理を複数回行う場合:各回の処理で5分間光照射を行い、最後の回のみ15分間光照射する。
  7. サンプルをスピンダウンし、95℃、5分間ヒートブロックで加熱する。[加熱殺菌]
*1短時間の緩やかなボルテックスもしくは数回のタッピングで混合してください。
*2 菌種によって最適な処理時間が異なる。死菌由来DNAのPCR増幅抑制が不十分な場合は、処理時間を延長する。
必要なら3~5の工程を2、3回繰り返して行う。
例)qPCR/PCR検出の増幅サイズが短い(100 bp前後)の場合は3~5の処理工程3回、増幅サイズが長い(1 kb前後)の場合は処理工程1回が標準である。
*3光照射装置がない場合は、氷上にチューブを横置きし、光照射用ランプを上部から照射する。下記の照射条件でも良好な結果が得られることを確認している。

ハロゲンランプ     照射距離20 cm
[岩崎電気株式会社、写真証明用アイランプ スポット(集光形)、PRS500W]
LED ランプ       照射距離2 cm
[Panasonic、EVERLEDS(エバーレッズ)LED 電球 6.9W(昼光色相当)、LDA7DA1]
C.NucleoSpin Tissue XSを用いたDNA抽出
  1. B.でEMA処理を行ったサンプル全量(55~65 μl)およびA.で氷上(もしくは4℃)保存していたサンプル液40 μl(+滅菌精製水 15~25 μl:EMA処理ありサンプルと揃える)*1に、それぞれBuffer T1を160 μl 加える。軽く混合して、スピンダウンする。
  2. さらにProteinase K*2を16 μl加える。ボルテックスにて混合(2×5秒)して、スピンダウンする。
  3. 56℃、10分間インキュベートする。
  4. スピンダウンしたサンプルにBuffer B3を160 μl 加える。ボルテックスにて混合(2×5秒)して、スピンダウンする。
  5. 70℃、5分間インキュベートし、ボルテックスする。
  6. 各サンプルが室温に戻ったことを確認して、スピンダウンしたサンプルにエタノール(96~100%)を160 μl加え、ボルテックスにて混合(2×5秒)して、軽くスピンダウンする。
  7. NucleoSpin Tissue XS ColumnをCollection Tube(2 ml)にセットする。
  8. 6.の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
  9. カラムを新しいCollection Tube(2 ml)にセットする。
  10. カラムにBuffer B5*3を50 μl添加し、11,000×g、1分間遠心する。
    ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
  11. カラムにBuffer B5*3を50 μl添加し、11,000×g、2分間遠心する。カラム上に液が残っていないことを確認する。
  12. カラムを1.5 mlマイクロチューブにセットする。
  13. カラムにBuffer BEを20 μl添加し、11,000×g、1分間遠心し、DNA溶液を回収する。
  14. 得られたDNA溶液の液量がおおよそ20 μlであることを確認する。
    *1 B-6.の加熱殺菌と同様の処理を行う。
    *2 Proteinase K製品コード 740901.50(50 回用)の場合:Proteinase K(凍結乾燥品)20 mg(1 vial)に、Proteinase Buffer 1 mlを加え溶解する。溶解後のProteinase K溶液は-20℃で保存する。
    *3 Buffer B5Wash Buffer B5(concentrate)2 mlあたり、8 mlのエタノールを加える。
D.リアルタイムPCRまたはエンドポイントPCRによる検出
C-13で調製したEMA処理あり及びEMA処理なしのDNA溶液を用いて、リアルタイムPCRまたはエンドポイントPCRにより、対象細菌のターゲット遺伝子の検出を行う。
また、EMA処理ありサンプルについては、Control Test Kit (Viable Bacteria Selection) (製品コード CY290)を用いて、本キットの試薬中に含まれる反応確認用プラスミドDNAが、EMA処理操作後、qPCR/PCRで検出されないことを確認することにより、本キットによるEMA処理操作が正しく行われたことを確認する。
この画面を閉じる