この画面を閉じる
Human Cell-Free Protein Expression Maxi System(製品コード 3285)

I. Tube-O-DIALYZER, MicroとSupplement Bufferの使用前準備
  1. Tube-O-DIALYZER, Microをパッケージから取り出し、透析膜付きキャップを外してチューブ内外の保存液を、ピペットや卓上遠心機などを使用し完全に除去する。チューブは透析反応で使用するまで埃がかからないよう保管する。
  2. 滅菌済の50 ml チューブ等に滅菌精製水を適量入れ、取り外した透析膜付きキャップを浸し軽く洗浄する。使用時までキャップの透析膜が乾燥しないよう滅菌精製水に浸して保管する。
  3. Supplement Buffer を-80℃より取り出し、室温にて融解する。
II. タンパク質合成反応
  1. Human Cell-Free Protein Expression Systemに含まれる以下の試薬を氷上にて融解する。適切な反応チューブに分注し、穏やかにピペッティングを行い、これらを十分混合する。
    Cell Lysate36 μl
    Mixture-124 μl
    Mixture-24 μl
  2. 室温にて10分間静置する。
  3. 2. の10分間静置中に、I.の3.で融解しておいたSupplement Buffer 3 mlをMicro Dialysis Cupへ添加し、撹拌用にミニスターラーバーを投入する。使用時まで埃が入らないよう保管する。
  4. 以下の各試薬を氷上にて融解し、2. の反応チューブに添加する。全ての試薬を添加後、反応液をピペッティングにより穏やかに十分混合する。
    (注)反応液の粘度は非常に高いため、ピペッティングを10~20回程度行い十分に混合してください。混合が不十分な場合、発現量が低下することがあります。
    Mixture-38 μl
    発現プラスミド(0.3 μg/μl)4 μl
    T7 RNA Polymerase4 μl
  5. I. で準備した透析用チューブへ4. で調製した反応液(80 μl)を移す。洗浄済みの透析膜付きキャップを取り出し、ピペット等で透析膜を傷つけないよう注意しながら内外の水分を除去し、透析用チューブにキャップをする。
  6. 透析用チューブを反転させ反応液(内液)をチューブ内側の透析膜に接触させる。この時、反転させたチューブ上部に反応液が残っている場合は、軽く振り下ろすことにより反応液全量をチューブ下部に落とし、反応液と透析膜を接触させる。
  7. 反転させた透析用チューブをFloatで固定して、3. で準備したMicro Dialysis Cup中のSupplement Buffer(外液)へ透析膜が接触するよう設置する。この時、透析膜とSupplement Buffer(外液)の間に気泡が入らないよう注意する。(下図参照)
    Maxi Systemを使用した透析法によるIn vitro Translation (IVT) 反応の設置例
    Maxi Systemを使用した透析法によるIn vitro Translation (IVT) 反応の設置例
  8. エアインキュベーター中で穏やかにマグネティックスターラーで撹拌*1を行いながら透析法でのIn vitro Translation (IVT) 反応を行う。32℃で12~24時間*2反応を実施する。
    (注)撹拌を開始した際に、透析膜とSupplement Bufferの間の気泡の有無を再度確認し、気泡がある場合はMicro Dialysis Cupを傾けて除去してください。
    *1 十分な撹拌を行うためにマグネティックスターラーの使用を推奨しますが、シェーカーを使用した撹拌による透析反応も可能です。但し、予め使用するシェーカーでの撹拌試験を行い、十分な撹拌ができることを確認してください。
    *2 目的タンパク質によって最適な反応時間が異なる場合があります。通常は12~18時間の反応をお勧めします。
  9. 反応終了後、スピンダウンして反応液を透析用チューブ下部に回収する。透析膜付キャップを取り外し、保存用の新しいチューブに反応液を移す。
  10. 各種解析に使用するまで-80℃で保存する。
合成されたタンパク質はSDS-PAGEウェスタンブロット解析等によって検出することができる。別売のタグ融合型発現ベクターを使用すれば、目的タンパク質の用途に応じたタグ(His, c-Myc)を付加することができ、ウェスタンブロット解析による発現確認や精製にも有効である。
III. 操作上の注意
  1. 発現プラスミドとMixture-1を除く各試薬は必ず氷上にて融解後直ぐに使用し、使用後は速やかに-80℃にて保存してください。
  2. Cell Lysateは小分け分注して保存することをお勧めします。
  3. Mixture-3添加時に不溶物が生じる場合がありますが、性能上は問題ありません。
  4. その他、Human Cell-Free Protein Expression System(製品コード 3281)の説明書も参照ください。


この画面を閉じる