EMA処理条件の検討
A. 生菌サンプル、死菌サンプルの準備
対象とする細菌の生菌サンプル【培養した細菌の懸濁液など】と死菌サンプル【生菌サンプルを熱処理したものなど】を準備し、6段階程度に段階希釈して検体サンプルとする。それぞれについて、EMA処理を行ったものと行わないものを調製し、比較検討して最適なEMA処理条件を決定する。
(1)生菌サンプル／EMA処理なし
(2)生菌サンプル／EMA処理あり
(3)死菌サンプル／EMA処理なし
(4)死菌サンプル／EMA処理あり
→(1)と(2)の結果を比較し、EMA処理による「生菌由来DNAへの影響」と「検出感度」の確認を行う。
→(3)と(4)の結果を比較し、EMA処理による「PCR増幅を抑制可能な死菌量」を求める。
検体サンプルはそれぞれ100 μl程度を用意し、40 μlをEMA処理に使用する。残りは氷上もしくは4℃で保存して、40 μlをEMA処理なしサンプルとして「C. NucleoSpin Tissue XSを用いたDNA抽出」に用いる。
(1)生菌サンプル／EMA処理なし
(2)生菌サンプル／EMA処理あり
(3)死菌サンプル／EMA処理なし
(4)死菌サンプル／EMA処理あり
→(1)と(2)の結果を比較し、EMA処理による「生菌由来DNAへの影響」と「検出感度」の確認を行う。
→(3)と(4)の結果を比較し、EMA処理による「PCR増幅を抑制可能な死菌量」を求める。
検体サンプルはそれぞれ100 μl程度を用意し、40 μlをEMA処理に使用する。残りは氷上もしくは4℃で保存して、40 μlをEMA処理なしサンプルとして「C. NucleoSpin Tissue XSを用いたDNA抽出」に用いる。
B. EMA処理
菌種およびPCR増幅サイズにあわせて、以下の2項目について処理条件を最適化する。
※操作は氷上で行うこと。
＜ご参考＞
ハロゲンランプ [ 岩崎電気株式会社、写真証明用アイランプ・スポット（集光形）、PRS500W ]を使用する場合は、氷上にチューブを横置きし、照射距離20 cmで上部から照射してください。
ただし、光照射時間は5分間で行ってください。
（照射時間の例）
EMA 処理を1回のみ行う場合 ： 5分間光照射する。
EMA 処理を複数回行う場合 ： 各処理の光照射は5分とする。
- PCR増幅サイズに応じて、処理回数を変更（B-4からB-6のステップ）
- 菌種によって、氷上静置時間を変更（B-5のステップ）
- 菌種によって、Solution B-gp濃度を変更（B-1のステップ）
※操作は氷上で行うこと。
- 必要に応じてSoution B-gpをDilution Bufferで希釈する。（用時調製）
- 1.5 ml チューブにA. で調製したサンプル液40 μlを準備する。
- Solution A-gp 10 μlを添加し、混合＊2後、軽くスピンダウンする。
- Solution B-gp（またはSolution B-gp 希釈液）5 μlを添加し、混合＊2後、軽くスピンダウンする。
- 遮光して氷上で5（～15）分間静置する。
- 光照射装置にセットし、光照射する。（低温：4℃もしくは氷上）
（照射時間の例）
EMA 処理を1 回のみ行う場合 ： 15分間光照射する。
EMA 処理を複数回行う場合 ： 各回の処理で5分間光照射を行い、最後の回のみ15分間光照射する。 - 必要に応じて、4.～6.の工程を繰り返す。
- サンプルをスピンダウンし、95℃、5分間ヒートブロックで加熱する。[加熱殺菌]＊3
A. で氷上（もしくは4℃）保存していた懸濁液40 μl（＋15～25 μl滅菌精製水：EMA処理を行ったサンプルと液量を揃える）も8. の加熱殺菌と同様の処理を行う。＊3
| ＊1 | 光照射は4℃（もしくは氷上）で行う。 光照射装置のAC アダプターが結露すると感電や火災の恐れがあるので、結露しないように注意する。低温室（4℃）で光照射を行う場合、光照 射装置の低温室からの出し入れは避ける。冷蔵庫を利用する場合は、光照射装置の本体のみを冷蔵庫に入れ、ACアダプター部分は室温に置いて使用する。 光照射装置がない場合、あるいはACアダプターが結露しないように保冷できない場合は、LEDランプ [ Panasonic、EVERLEDS（エバーレッズ）LED 電球6.9W（昼光色相当）、LDA7DA1 ] を用いて、氷上にチューブを横置きし、照射距離2 cmで上部から照射する。この方法で同等の結果が得られることを確認している。 |
| ＊2 | 短時間の緩やかなボルテックスもしくは数回のタッピングで混合する。 |
| ＊3 | 対象菌種に適した方法（条件）で加熱殺菌（不活化処理）を行う。 |
＜ご参考＞
ハロゲンランプ [ 岩崎電気株式会社、写真証明用アイランプ・スポット（集光形）、PRS500W ]を使用する場合は、氷上にチューブを横置きし、照射距離20 cmで上部から照射してください。
ただし、光照射時間は5分間で行ってください。
（照射時間の例）
EMA 処理を1回のみ行う場合 ： 5分間光照射する。
EMA 処理を複数回行う場合 ： 各処理の光照射は5分とする。
C．NucleoSpin Tissue XSを用いたDNA抽出
- B.-8. で加熱殺菌（不活化処理）を終えたサンプル全量（55～65 μl）に、それぞれ20 mg/ml lysozyme in 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 1％ Triton X-100 (pH8.0)＊1 を160 μl加える。軽く混合して、スピンダウンし、37℃で30～60分インキュベートする。
- Proteinase K＊216 μlを添加し、56℃で1～3時間（または一晩）完全に溶解するまでインキュベートする。
- スピンダウンしたサンプルにBuffer B3を160 μl加える。ボルテックスにて混合（5秒×2）して、スピンダウンする。
- 70℃、5分間インキュベートし、ボルテックスする。
- 各サンプルが室温に戻ったことを確認して、スピンダウンしたサンプルにエタノール（96～100%）を160 μl加え、ボルテックスにて混合（5秒×2）して、軽くスピンダウンする。
- NucleoSpin Tissue XS ColumnをCollection Tube（2 ml）にセットする。
- 6. の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
- カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。
- カラムにBuffer B5＊3を50 μl添加し、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。 - カラムにBuffer B5＊3を50 μl添加し、11,000×g、2分間遠心する。
カラム上に液が残っていないことを確認する。 - カラムを1.5 ml マイクロチューブにセットする。
- カラムにBuffer BEを20 μl添加し、11,000×g、1分間遠心し、DNA溶液を回収する。
- 得られたDNA溶液の液量がおおよそ20 μlであることを確認する。
＊1 NucleoSpin Tissueに含まれないため、別途用意する。 ＊2 Proteinase K ： 製品コード 740901.50（50 回用）の場合：
Proteinase K（凍結乾燥品）20 mg（1 vial）に、Proteinase Buffer 1 mlを加え溶解する。溶解後のProteinase K溶液は－20℃で保存する。＊3 Buffer B5 ： Wash Buffer B5 (concentrate) 2 mlあたり、8 mlのエタノールを加える。
D．リアルタイムPCRまたはエンドポイントPCRによる検出
C-13で調製したEMA処理あり及びEMA処理なしのDNA溶液を用いて、リアルタイムPCRまたはエンドポイントPCRによりターゲット遺伝子の検出を行い、「生菌由来DNAへの影響」「検出感度」を確認し、「EMA処理によるPCR増幅を抑制可能な死菌量」を求める。（「条件検討例およびモデル実験」の項目1、2を参照）
