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プラスミドミニプレッププロトコール(NucleoSpin® Plasmid EasyPure)

NucleoSpin® Plasmid EasyPure(製品コード 740727.10,740727.50,740727.250)
 試薬の準備
 Buffer A1(+RNase A)*1, Buffer AQ*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1.培養液の調製
集菌
大腸菌の培養液2~10 mlを12,000×gで30秒間遠心し、上清をできるだけ除去する。
2. 菌の溶解
細胞ペレットにBuffer A1(+RNase A)*1150 μlを加え、ボルテックスまたはピペッテイングで完全に溶解する。
Buffer A2*3 250 μlを加え、チューブを5回反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
2分間またはライセートが清澄化するまで室温で静置する。
Buffer A3 350 μlを加え、LyseControlの青色が完全に無色になるまでチューブを反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
3.ライセートの清澄化
2の溶液を12,000×g、3分間室温で遠心する。
4.カラムへの吸着
NucleoSpin Plasmid EasyPure ColumnをCollection Tube (2 ml)にセットする。
3の上清を最大750 μlをカラムに添加し、1,000~2,000×g、30秒間遠心する。
ろ液を捨て、カラムを同じCollection Tubeにセットする。
5.メンブレンの洗浄・乾燥
Buffer AQ*2 450 μlをカラムに添加し、12,000×gで1分間遠心する。
Collection Tubeからカラムの先がろ液に触れないように、カラムを注意深くはずす。
(エタノールのキャリーオーバーを防ぎたい場合は37℃で10~15分間インキュベートする。)
6.DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
Buffer AE 50 μlを添加し、室温で1分間インキュベートした後、12,000×gで1分間遠心する。

溶出液をプラスミド溶液として保存する。

Buffer AEの組成:5 mM Tris-HCl、pH8.5
*1Buffer A1(+RNase A)の調製法
Liqid RNase A全量をBuffer A1のボトルに移す。 RNase Aを添加したBuffer A1は、4℃で6ヵ月安定である。
*2Buffer AQの調製法
Wash Buffer AQ(concentrate)に、4倍量のエタノール(96~100%)を添加する。
*3Buffer A2に沈殿が生じている場合は、30~40℃で数分温めて沈殿を完全に溶解ししてください。
溶解後、Buffer A2を室温(18~25℃)に戻してから使用してください。

<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。
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