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Protocols

NucleoBond® Xtra Midi/Maxi EF

プラスミド精製プロトコール(高コピープラスミド用)

NucleoBond® Xtra Midi EF(製品コード 740420.10,740420.50)
 試薬の準備Resuspension Buffer RES-EF(+RNase A)*1, 70%エタノール*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1~3培養液の調製
集菌
培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。
 培養液の液量(V)=400/ OD600 (ml) *3
培養液を、4℃、4,500~6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
4~5菌の溶解菌ペレットを、Resuspension Buffer RES-EF(+RNase A)*1 8 ml*4 に完全に懸濁する。
Buffer LYS-EF 8 ml*4 を菌懸濁液に加え、5回倒置撹拌する。ボルテックスをしてはならない。
室温で、5分間静置する。
6カラムの平衡化
カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU-EF 15 mlで平衡化する。
図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。
フィルター全体が湿っていることを確認する。
7中和Buffer NEU-EF 8 ml*4 を、3の細胞懸濁液に加え、直ちに10~15回倒置撹拌する。ボルテックスはしてはならない。
氷上で5分間静置する。
8ライセートの清澄化とローディング4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。
液を自然落下させてカラムを空にする。
9カラムの洗浄(1回目)
Buffer FIL-EF 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。
図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
10カラムフィルターの廃棄
カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
11カラムの洗浄(2回目)
Wash Buffer ENDO-EF 35 mlで、カラムを洗浄する。
12カラムの洗浄(3回目)
Wash Buffer WASH-EF 15 mlで、カラムを洗浄する。
13溶出Elution Buffer ELU-EF*5 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。
溶出液を15 ml遠心チューブ(各自で用意)に集める。
14沈殿イソプロパノール(室温)を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。
5,000×g以上で15分以上室温以下(好ましくは15,000×gで30分間、4℃)で遠心する。
上清を注意深く除去する。
15DNAペレットの洗浄と乾燥70%エタノール(室温)2 mlを沈殿に加え、5,000×g(好ましくは15,000×g)以上で5分間、室温で遠心する。
エタノールをチューブから完全に除去する。
5~10分間乾燥する。(乾燥しすぎるとDNAが溶解しにくくなるので注意する。)
16DNAの溶解適量のBuffer TE-EFまたはH2O-EFで溶解する。

*1 Buffer RES(+RNase A)の調製法
RNase A(凍結乾燥品)のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
*2 70% エタノールの調製法(製品コード 740420.10(10回用)の場合)
70% エタノールのラベルのボトル(9 mlのendotoxin-free water)に21 mlの96~100% エタノールを添加し、混合する。
*3 低コピープラスミドの場合は、培養液の液量(V)=800/ OD600 (ml)
*4 低コピープラスミドの場合は、16 ml
*5 BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。

<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。

*2は、製品コード 740420.10(10回用)の場合の調製法です。
製品コード 740420.50(50回用)の場合の調製法は英文説明書をご参照ください
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