この画面を閉じる

Protocols

Human iPS Cell Generation™ Episomal Vector Mix

ヒト末梢血単核球からの幹細胞/前駆細胞を標的としたiPS細胞の樹立(6 well plateの場合)

Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix(製品コード 3673)
(Day -6)幹細胞/前駆細胞の培養
   凍結単核球の解凍
  1. 15 mlチューブに幹細胞/前駆細胞用培地を2 ml分注し、37℃の湯浴槽にて加温する。
  2. 9 mlのStemSpan H3000(サイトカイン不含)を15 mlチューブに分注する。
  3. 凍結単核球のバイアルを37℃の湯浴槽にて融解する。
  4. 少し氷が残るくらいで湯浴槽から引き上げ、2. のチューブに融解後の細胞懸濁液を入れる。
  5. 200×g、18℃で10分間遠心する。
  6. 上清を吸引除去する。
  7. 5 mlのStemSpan H3000(サイトカイン不含)を加えて懸濁する。
  8. 細胞数を計測する。
  9. 3×106個を15 mlチューブに分注する。
  10. 200×g、18℃で10分間遠心する。
  11. 上清を吸引除去する。
  12. 加温済みの幹細胞/前駆細胞用培地に再懸濁し、6 well plateの1 wellに播種する。
  13. インキュベーター(37℃、5% CO2)で6日間培養する。
  14. 培地交換は不要
    6日目の培養細胞数は1×106個程度になる。


(Day -1)Feeder 細胞の準備
  1. 6 well tissue culture plateに0.1%ゼラチン水溶液を添加し、37℃で30分間インキュベートする。
  2. 6 well tissue culture plateから0.1%ゼラチン水溶液を吸引除去する。
  3. 2. のゼラチンコート済み6 well tissue culture plateに、10% FBS/DMEM培地を用いてFeeder細胞を3×105個/wellで播種する。
  4. インキュベーター(37℃、5% CO2)で一晩培養し、細胞を容器底面に接着させる。


(Day 0)エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
  1. 15 mlチューブに幹細胞/前駆細胞用培地を0.9 ml分注し、37℃の湯浴槽にて加温する。
  2. Day -1で準備したFeeder細胞より培地を吸引除去し、幹細胞/前駆細胞培地を1.5 ml添加する。
  3. 培養した幹細胞/前駆細胞を回収し、細胞数を計測する。
  4. 15 mlチューブに、3. の細胞を1×106個分注する。
  5. 200×g、室温で10分間遠心し回収する。
    この間に、以下のエレクトロポレーション液(幹細胞/前駆細胞用)を作製する。
    Human CD34 Cell Nucleofector Solution*282 μl
    Supplement*218 μl
    Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix3.5 μl
  6. 遠心終了後、上清を完全に取り除く。
  7. エレクトロポレーション液(幹細胞/前駆細胞用)に細胞を懸濁し、キュベット*2に移す。
  8. Nucleofector II Deviceにキュベットを差し込み、プログラム U-008でエレクトロポレーションを行う。
  9. 1. の幹細胞/前駆細胞用培地に、エレクトロポレーション後の細胞を素早く懸濁する。
  10. 2.で準備したFeeder細胞上に細胞を播種し、インキュベーター(37℃、5% CO2)で培養する。
    細胞は5~20×104個/wellを目安に播種してください。
    *2Human CD34 Cell Nucleofector Kitには、Human CD34 Cell NucleofectorSolution、Supplement、キュベットが含まれています。


(Day 2、4、6)ヒトiPS細胞培養用培地の追加
ヒトiPS 細胞培養用培地1.5 mlを静かに添加する。


(Day 8)ヒトiPS細胞培養用培地での培養
培地を吸引除去し、ヒトiPS細胞培養用培地2 mlを添加する。
以降、培地の交換は2日に1回行う。
培養開始後20~30日目にiPSコロニーが認められる。
この画面を閉じる