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Protocols

Human iPS Cell Generation™ Episomal Vector Mix

ヒト末梢血単核球からのT細胞を標的としたiPS細胞の樹立(6 well plateの場合)

Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix(製品コード 3673)
(Day -1)Feeder 細胞の準備
  1. 6 well tissue culture plateに0.1%ゼラチン水溶液を添加し、37℃で30分間インキュベートする。
  2. 6 well tissue culture plate から0.1%ゼラチン水溶液を吸引除去する。
  3. 2. のゼラチンコート済み6 well tissue culture plateに、10% FBS/DMEM培地を用いてFeeder細胞を3×105 個/wellで播種する。
  4. インキュベーター(37℃、5% CO2)で一晩培養し、細胞を容器底面に接着させる。


(Day 0)エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
   凍結単核球の解凍
  1. 9 mlのX-VIVO 15(IL-2、CD3/CD28 beads不含)を15 mlチューブに分注する。
  2. 凍結単核球のバイアルを37℃の湯浴槽で融解する。
  3. 少し氷が残るくらいで湯浴槽から引き上げ、1. の培地に融解済みの細胞懸濁液を加える。
  4. 200×g、18℃で10分間遠心する。
  5. 上清を吸引除去する。
  6. 5 mlのX-VIVO 15(IL-2、CD3/CD28 beads 不含)に懸濁する。
  7. 細胞数を計測する。

   エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
  1. 15 mlチューブに単核球用培地を0.9 ml分注し、37℃の湯浴槽にて加温する。
  2. Day -1で準備したFeeder細胞より培地を吸引除去し、単核球用培地を2 ml添加する。
  3. 15 mlチューブに単核球3×106個を分注する。
  4. 200×g、室温で10分間遠心し回収する。
    この間に、以下のエレクトロポレーション液(T細胞用)を作製する。
    Human T cell nucleofector solution*382 μl
    Supplement*318 μl
    Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix3.5 μl
  5. 遠心終了後、上清を完全に取り除く。
  6. 3. のエレクトロポレーション液(T細胞用)に細胞を懸濁して、キュベット*3に移す
  7. Nucleofector Ⅱ Deviceにキュベットを差し込み、プログラムV-024にてエレクトロポレーションを実施する。
  8. 1. の単核球用培地に、エレクトロポレーション後の細胞を素早く懸濁する。
  9. 2.で準備したFeeder細胞上に、エレクトロポレーション後の細胞を播種し、インキュベーター(37℃、5% CO2)で培養する。
    細胞は1~30×104個/wellを目安に播種してください。
    *3Human T cell Nucleofector Kitには、Human T cell Nucleofector solution、Supplement、キュベットが含まれています。

(Day 2、4、6)ヒトiPS細胞培養用培地の追加
ヒトiPS細胞培養用培地1.5 mlをディッシュの壁面から静かに添加する。



(Day 8)ヒトiPS細胞培養用培地での培養
培地を全て吸引除去し、ヒトiPS細胞培養用培地2 mlを添加する。
以降、培地の交換は2日に1回行う。
培養開始後20~30日目にiPSコロニーが認められる。
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