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Protocols

CycleavePCR™ O-157(VT gene) Screening Kit Ver.2.0

食品からの腸管出血性大腸菌検査のためのDNA抽出プロトコール

NucleoSpin Tissue(製品コード 740952.10、740952.50、740952.250)
使用時には必ず取扱説明書をご確認ください。
1. サンプルの準備
 

マイクロチューブに増菌培養液*1 0.1 mlを入れ、10,000×gで10分間遠心して上清を除去し、細菌のペレットを用意する。

2. Proteinase K処理

Buffer T1 180 μl, Proteinase K溶液*2 25 μlを細菌のペレットに添加し、激しく攪拌する。56℃で1時間インキュベートする。

注:1時間で溶解しなかった場合:56℃でのインキュベートを3時間(~一晩)まで延長し、完全に溶解する。

3. サンプルの溶解

サンプルを撹拌する。Buffer B3 200 μlを加えて、激しく撹拌した後、70℃で10分間インキュベートする。
不溶物が残る場合は11,000×gで5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。

4. エタノールの添加

96~100%エタノール 210 μlを添加し、よく混合する。

5. カラムへの吸着

NucleoSpin Tissue ColumnをCollection Tubeにセットする。
4.の溶液をカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨て、新しいCollection Tubeにカラムをセットする。

6. メンブレンの洗浄

1回目の洗浄
Buffer BW 500 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

2回目の洗浄
Buffer B5*2 600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

7. メンブレンの乾燥
 

カラムを、11,000×gで1分間遠心する。

8. DNAの溶出

カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
70℃に温めたBuffer BE*3 100 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、-20℃で保存する。(凍結融解はできるだけ繰り返さない)

*1 培養液の調製法
「腸管出血性大腸菌O26、O103、O111、O121、O145及びO157の検査法について」(食安監発1120第1号、平成26年11月20日)に記載された方法で、増菌培養を行う。
*2 Proteinase K溶液、Buffer B5の調製法はNucleSpin Tissue(製品コード 740952.10)の取扱説明書に従ってください。
*3 Buffer BEの組成:5 mM Tris-HCl, pH8.5

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