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Protocols

Lentiviral High Titer Packaging Mix with pLVSINシリーズ

pLVSINレンチウイルスベクタープラスミドからの組換えレンチウイルスの産生

Lentiviral High Titer Packaging Mix(製品コード 6194)
Lenti-X 293T細胞とLentiviral High Titer Packaging Mixを用いた組換えレンチウイルスの産生

Lentiviral High Titer Packaging Mixを用いて高力価のレンチウイルスを得るには、Lenti-X 293T細胞を使用し、以下のプロトコールに厳密に従う必要がある。特に、(1)培養サイズと容量、(2)DNAの量とトランスフェクションに適した品質、(3)インキュベーション時間は厳守する。

以下のプロトコールは、pLVSINレンチウイルスベクタープラスミドとLentiviral High Titer Packaging Mixを用いて、Lenti-X 293T細胞へ導入してウイルス産生を行うことを前提に最適化されている。

すべてのステップは安全キャビネットの中で行う。レンチウイルスの取扱いには、レンチウイルスの使用を承認されたバイオセーフティーレベルの設備が必要である。HIV-1由来ベクターでパッケージングされた組換えレンチウイルスはヒト細胞への感染力がある。適切な安全措置を講じること。
  • Lenti-X 293T細胞播種
    Lenti-X 293T細胞を100 mm細胞培養用ディッシュに5.0×106 cells/10 ml/dishで播種*1し、5% CO2インキュベーター内で37℃にて一晩培養する。
    培地には10% FBS含有DMEM培地を使用する。1% Penicillin-Streptomycinを添加したDMEM培地も使用できる。
    *1 トランスフェクション試薬にCalPhos Mammalian Transfection Kit(製品コード 631312)を使用する場合は2.5×106 cells/10 ml/dishで播種する。
  • トランスフェクション(細胞播種翌日)
    pLVSINレンチウイルスベクタープラスミドとLentiviral High Titer Packaging MixをLenti-X 293T細胞へトランスフェクトする。
    トランスフェクション試薬は以下の2種類を推奨。
    aは安定して高力価のレンチウイルスを取得するのに適しており、bは比較的安価にトランスフェクションを行うことができる。本製品を使用して高力価のレンチウイルスを取得するにはTransIT-293 Transfection Reagentの使用を強く推奨する。
    以下に、それぞれの試薬を使用した場合のトランスフェクションプロトコールを紹介する。

    a.TransIT-293 Transfection Reagent(製品コード MIR2704)を使用する場合
    (手順の詳細はTransIT-293 Transfection Reagentの取扱説明書を参照。)
    1.TransIT-293 Transfection Reagentを室温に戻し、使用前にボルテックスで混合する。
    2.2.0 mlチューブを使用し、以下の混合比で無血清のDMEMとプラスミドDNAを混合し、穏やかにピペッティングして完全に混合する。
    Lentiviral High Titer Packaging Mix
    7 μl
    0.5 μg/μl pLVSIN Vector
    11 μl
    無血清DMEM
    1,500 μl
    Total
    1,518 μl

    3.2.で作製した混合液に45μlのTransIT-293 Transfection Reagentを添加し、穏やかにピペッティングして混合し、15~30分、室温で静置する。
    4.前日に播種したLenti-X 293T細胞に3.の混合液をすべて滴下し、5% CO2インキュベーター内で37℃にて培養を続ける。

    b.CalPhos Mammalian Transfection Kit(製品コード 631312)を使用する場合
    より高力価なレンチウイルスを取得するため、以下のプロトコールはCalPhos Mammalian Transfection Kitに添付のプロトコールを、本キットへの使用に合わせて一部改良している。

    1.2×HEPES-Buffered Saline、2 M Calcium Solution、Sterile H2Oを室温に戻しておく。
    2.以下の混合比でプラスミドDNAとカルシウム溶液を15 mlチューブ中で混合する。
    Lentiviral High Titer Packaging Mix
    7 μl
    0.5 μg/μl pLVSIN Vector
    11 μl
    2 M Calcium Solution
    87 μl
    Sterile H2O
    595 μl
    Total
    700 μl

    3.2×HEPES-Buffered Salineが室温に戻っていることを確認し、2.の総量と等量(700 μl)の2×HEPES-Buffered Salineを添加し、チューブにフタをして上下に15回激しく振って混和する。
    4.5分間室温にて静置する。
    静置時間は5分間を厳守し、5分経過後は速やかに次の工程に進める。
    静置時間が長くなるとリン酸カルシウム-DNAの結晶が大きくなりすぎて、トランスフェクション効率が低下することがある。
    5.前日に播種したLenti-X 293T細胞に4.の混合液を滴下し、5% CO2インキュベーター内で37℃にて培養を続ける。
  • 培地交換
    トランスフェクションから約24時間後に新しい10% FBS含有DMEM 10 mlに交換する。
    1% Penicillin-Streptomycinを添加したDMEM培地も使用できる。
    CalPhos Mammalian Transfection Kitを使用してトランスフェクションを実施した場合は、顕微鏡観察により、リン酸カルシウムの結晶を確認することができる。
  • レンチウイルス液の回収
    1.トランスフェクションから約48時間後にレンチウイルスを含む培養上清を回収する。
    2.回収した培養上清をを0.45 μmフィルターでろ過し、これをレンチウイルス液とする。
    調製したレンチウイルス液は、直ちに使用しない場合、-80℃で長期間保存することができる。凍結融解を繰り返すごとにウイルス力価は低下しますので少量ずつ分注して保存することをお勧めする。(Higashikawa, et al ., 2001)
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