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Protocols

iPS/ヒトES(hES)細胞作製・分化

タカラバイオでのiPS細胞作製例

作業の流れ


Step1. 検体受入
標的細胞(ヒト皮膚線維芽細胞など)をご提供ください。
・生存率90%以上、1週間の増殖率5倍以上
・細胞数1×105以上
・HIV、HCV、HBV陰性

Step2. iPS細胞誘導因子の遺伝子導入
凍結細胞を解凍し、前培養を行った後、遺伝子導入を行います。
・エピソーマルベクターによる遺伝子導入の場合
 エピソーマルベクターを標的細胞に導入します。
・レトロウイルスによる遺伝子導入の場合
 Human iPS Cell Generation All-in-One Vector等からG3T-hi細胞を用いて組換えレトロウイルスベクターを作製します。
 RetroNectin遠心RBV法にて標的細胞への遺伝子導入を高効率で行います。

Step3. iPS細胞誘導
ES細胞培養用培地を用いて培養し、遺伝子導入細胞からのiPS細胞誘導を行います。
・エピソーマルベクターによる遺伝子導入の場合
 RetroNectinをコーティングした培養容器に遺伝子導入細胞を播種し、誘導培養を行います。RetroNectinによる効率的なiPS細胞作製が期待できます。
・レトロウイルスによる遺伝子導入の場合
 遺伝子導入細胞をFeeder細胞上(STO細胞)に播種し、誘導培養を行います。
 ※誘導培養においてiPS細胞コロニーが見られない場合、お客様とご相談の上、作業を中断することがございます。予めご了承ください。

Step4. iPS細胞のクローン化
iPS細胞コロニーをピックアップし、新たに調製したFeeder細胞上に播種します。拡大培養を行い、十分な細胞数になるまで培養を継続後、凍結保存します。以下の品質確認を行います。
・ES細胞様の形態を確認(写真添付)
・Alkaline phosphatase染色陽性であること
・マイコプラズマ陰性であること
・受け入れた細胞とiPS細胞の遺伝的同一性を確認(STR分析
※納品時細胞数は1~5×105個程度
 (融解後の生細胞数、及び生育は保証しません。ただし、弊社内で融解後10~50%程度起床することを確認します。)
※標準仕様では、1検体から5クローンを納品いたします。
※iPS細胞は凍結し、ドライシッパーを準備し輸送いたします。細胞をお受け取り頂いた後は、ドライシッパーをご返送いただいております。
iPS細胞作製の流れ iPS細胞作製の流れ
ES細胞様の形態 アルカリフォスファターゼ染色陽性
タカラバイオ製 TRACP & ALP double-stain Kit(製品コード MK300)使用。
コロニーが青紫に染色される。


Step5. オプション解析
・テラトーマ形成
・残存ウイルス確認試験
・未分化マーカーの免疫染色
ICELL8 シングルセル解析
CGH/CNV Array解析、染色体解析
ヒト全ゲノムシーケンス解析
エクソーム解析
トランスジーンの挿入位置同定
DNAメチル化解析(ビーズアレイ)
・バンキング 等
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