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Protocols

TB Green® Fast qPCR Mix

Thermal Cycler Dice® Real Time System III、II、およびLiteを用いる場合の操作方法

TB Green Fast qPCR Mix(製品コード RR430S/A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    TB Green Fast qPCR Mix(2×)12.5 μl

    PCR Forward Primer(10 μM)1 μl
    0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)1 μl
    0.4 μM*1
    template(<100 ng)*22 μl

    滅菌精製水8.5 μl

    total25 μl*3
  2. 反応を開始する。

    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。

    シャトルPCR標準プロトコール
    シャトルPCR標準プロトコール

    Holding(初期設定)
      Cycle:1
      95℃、30秒
    2 Step PCR*4
      Cycle:40
      95℃、5秒
      60℃、10秒
    Dissociation

    ※使用上の注意
    本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time System取扱説明書を参照してください。
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