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Protocols

TB Green® Fast qPCR Mix

Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System およびStepOnePlus™ Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

TB Green Fast qPCR Mix(製品コード RR430S/A/B)
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
  1. 下記に示す PCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    TB Green Fast qPCR Mix(2×)10 μl
    25 μl

    PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μl
    2 μl
    0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl
    2 μl
    0.4 μM*1
    ROX Reference Dye(50×)or Dye II(50×)*20.4 μl
    1 μl

    template(<100 ng)*32 μl
    4 μl

    滅菌精製水6 μl
    16 μl

    total20 μl*450 μl*4

  2. 反応を開始する。

    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。(PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。)


    <Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>
    Stage 1:初期変性
      Reps:1
      95℃、30秒
    Stage 2:PCR反応
      Reps:40
      95℃、5秒
      60℃、10秒~15秒*
    Stage3:Melt Curve

    <Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>
    シャトルPCR標準プロトコール
    Holding Stage
      Reps:1
      95℃、30秒
    Cycling Stage
      Number of Cycles:40
      95℃、3秒
      60℃、12秒~15秒*
    Melt Curve Stage

    ※使用上の注意
    本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
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