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血漿・血清からのウイルス核酸精製プロトコール(NucleoSpin® Virus)

NucleoSpin Virus(製品コード 740983.10/740983.50/740983.250)

試薬の調製Buffer VW2*1が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
また、Carrier RNA*2がRNase free水で溶解され、stock溶液が調製されていることを確認する。
1.サンプルの溶解
Collection Tube(1.5 ml:蓋付)にProteinase K 5 μlを分注する。200 μlのサンプルをこのチューブに添加し、ピペッティングで混合する。
200 μlのBuffer VLを加え、vortexで10~15秒緩やかに混合する。
5.6 μlのCarrier RNA Stock溶液を加え、緩やかに混合する。室温で3分間放置する。
(必要なら、各ステップで軽く遠心して、蓋についた液を落とす。)
2.エタノールの添加
1. の溶液に200 μlのエタノール(96~100%)を添加し、vortexで10~15秒混合する。
室温で5分間放置する。
軽く遠心して、蓋についた液を落とす。強く遠心して沈殿が生じないように注意する。
3.カラムへの吸着
NucleoSpin Virus ColumnをCollection Tube(2 ml:蓋なし)にセットする。
2. の溶液610 μlをカラムに加え、4,000×g、3分間遠心する。*3
ろ液を捨てた後、新しい2 mlのCollection Tubeにカラムをセットする。
4.メンブレンの洗浄

1回目の洗浄
Buffer VW1 400 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、新しい2 mlのCollection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer VW2 400 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、新しい2 mlのCollection Tubeにカラムをセットする。
3回目の洗浄
Buffer VW2 200 μlをカラムに添加し、最高速(最大20,000×g)で5分間遠心する。
ろ液を捨てた後、新しい1.5 mlのCollection Tubeにカラムをセットし、蓋を開けて56℃で5分間乾燥させる。
5.DNAの溶出
70℃で予温したRNase free水 30 μlを添加し、室温で3分間インキュベートする。 20,000×gで3分間遠心し、核酸を溶出させる。
*1Buffer VW2の調製法
製品コード 740983.10(10回用)の場合:Wash Buffer VW2 (Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール 24 mlを添加する。
*2Carrier RNA Stock溶液の調製法
製品コード 740983.10(10回用)の場合:300 μgの凍結乾燥品のCarrier RNAにRNase free水 300 μlを加えて溶解させる。溶解後は-20℃で保存する。
*3この遠心操作ですべての溶液がカラムを通過しなかった場合は、高速遠心(15,000~20,800×g)を1分間行う。これでも溶液がカラム上部に残っている場合には、新しい試料でやり直す方が望ましい。


<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書を確認すること。

*1*2は、製品コード 740983.10(10回用)の場合の調製法である。
製品コード 740983.50(50回用)、740983.250(250回用)の場合の調製法は英文説明書を参照すること。
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