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Protocols

NucleoSpin® RNA Stool

ヒト糞便からのRNA精製プロトコール

NucleoSpin RNA Stool(製品コード 740130.10/.50)
(ヒト以外の糞便サンプルについては英文プロトコールを参照してください。)
試薬の調製 Buffer RST1に沈殿がないことを確認する。もし沈殿がある場合には、40~50℃で保温して沈殿を溶解する。
Buffer RST5*1 、rDNase溶液*2が添付の英文説明書に従って調製されていることを確認する。
1.サンプルの準備
180~220 mgのヒト糞便試料をNucleoSpin Bead Tube Type Aに入れる。過剰量の試料を使用すると収量、純度が低下する可能性があるため注意する。
200 μlのNucleoZOLと660 μlのBuffer RST1を加えて蓋を閉める。
2.サンプルの溶解
Bead TubeをVortex mixer上のMN Bead Tube Holderにセットし、室温で10分間最高速度で振盪する。
13,000×g、5分間遠心する。
沈殿物や浮遊物を吸わないように510 μlの上清を2 mlの新しいチューブ(各自で用意)に移す。
3.PCR阻害物質の沈殿
Buffer RST2 140 μlを加えて、vortexで5秒間混合する。13,000×g、3分間遠心する。
4.溶解液の濾過
NucleoSpin Inhibitor Removal Column(赤リング)をCollection Tube(2 ml:蓋付)にセットする。
3.の上清 600 μlをカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。
5.Bufferの添加
Buffer RST2 180 μlを4.の上清に加えて、vortexで5秒間混合する(small RNAが不要な場合は加えるBuffer RST2 量を120 μlとする)。
6.カラムへの吸着
NucleoSpin RNA Stool Column(水色リング)をCollection Tube(2 ml)にセットする。
5.の上清600 μlをカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットし、残りの5.の上清をカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムを再セットする。
7.メンブレンの洗浄










1回目の洗浄
Buffer RST3 600 μlをカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
DNAの分解(DNAを同時抽出する場合は不要)
rDNase溶液 80 μlをカラムの中央に添加し、室温で15分間インキュベートする。
2回目の洗浄
Buffer RST4 600 μl をカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
3回目の洗浄
Buffer RST2 600 μl をカラムに添加し13,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
4回目の洗浄
Buffer RST5 600 μl をカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
8.メンブレンの乾燥
カラムをさらに13,000×gで2分間遠心する。カラムをCollection Tube内のろ液に触れないよう取り出す。
9.RNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
RNase free H2O 100 μlを添加し、蓋を閉めて、13,000×gで1分間遠心し、RNAを溶出させる。溶出後にvortexで2秒間撹拌しておく。
*1
Buffer RST5の調製法
製品コード 740130.10(10回用)の場合: Buffer RST5(Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール 24 mlを添加する。 製品コード 740130.50(50回用)の場合: Buffer RST5(Concentrate) 12 mlに96~100%エタノール 48 mlを添加する。

*2
rDNase溶液の調製法
rDNase 1 vialにReaction Buffer for rDNase 1.4 mlを加え、穏やかに混合しながら室温で1分間インキュベートし、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、-20℃に保存する(6ヵ月間安定)。凍結融解は3回までとする。

<注意>
使用前には、詳細なプロトコールは必ず添付の英文説明書で確認すること。
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