NucleoSpin^® RNA Stool

180～220 mgのヒト糞便試料をMN Bead Tubes Type Aに入れる。過剰量の試料を使用すると収量、純度が低下する可能性があるため注意する。
200 μlのNucleoZOLと660 μlのBuffer RST1を加えて蓋を閉める。

Bead TubeをVortex mixer上のMN Bead Tube Holderにセットし、室温で10分間最高速度で振盪する。
13,000×g、5分間遠心する。
沈殿物や浮遊物を吸わないように510 μlの上清を2 mlの新しいチューブ（各自で用意）に移す。

Buffer RST2 140 μlを加えて、vortexで5秒間混合する。13,000×g、3分間遠心する。

NucleoSpin Inhibitor Removal Column（赤リング）をCollection Tube（2 ml：蓋付）にセットする。
3.の上清 600 μlをカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。

Buffer RST2 180 μlを4.の上清に加えて、vortexで5秒間混合する（small RNAが不要な場合は加えるBuffer RST2 量を120 μlとする）。

NucleoSpin RNA Stool Column（水色リング）をCollection Tube（2 ml）にセットする。
5.の上清600 μlをカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットし、残りの5.の上清をカラムに加え、13,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムを再セットする。

1回目の洗浄 Buffer RST3 600 μlをカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。 DNAの分解（DNAを同時抽出する場合は不要） rDNase溶液 80 μlをカラムの中央に添加し、室温で15分間インキュベートする。
2回目の洗浄 Buffer RST4 600 μl をカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
3回目の洗浄 Buffer RST2 600 μl をカラムに添加し13,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
4回目の洗浄 Buffer RST5 600 μl をカラムに添加し、13,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。

カラムをさらに13,000×gで2分間遠心する。カラムをCollection Tube内のろ液に触れないよう取り出す。

カラムをマイクロチューブ（1.5 ml：各自で用意）にセットする。
RNase free H₂O 100 μlを添加し、蓋を閉めて、13,000×gで1分間遠心し、RNAを溶出させる。溶出後にvortexで2秒間撹拌しておく。