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TaKaRa Ex Taq®

PCRによる胃生検材料からのHelicobacter pyloriの検出

1983年、Marshall & Warrenによって発見されたHelicobacter pyloriは胃炎の原因菌で、発見以来、胃潰瘍をはじめとする種々の胃疾患との関連が注目されている。H. pyloriの発育は非常に遅く、培養での分離には1週間を要するが、PCRを用いれば、開始から遅くとも7時間後には、結果を判定することができる。しかし、胃炎患者より採取された胃生検材料を用いてPCR検出を行う際、通常のTaq DNA Polymeraseを用いたPCRでは、非常に増幅されにくいテンプレートDNAが存在する。今回、これらのテンプレートDNAを用い、高増幅型のDNA PolymeraseであるTaKaRa Ex Taqと通常のTaq DNA Polymeraseとの検出感度の比較データを神戸市環境保健研究所 細菌部の黒川 学先生よりご提供いただいたので、以下に示す。

■ 操作
胃生検材料
   ↓
細胞溶解
   │
   │
   │
   │
   ↓


100 μl細胞溶解液を加える
94℃、15分加熱
9 UのProteinase Kを加える
60℃、60分加熱
DNA抽出
   │
   │
   │
   │
   │
   │
   ↓


300 μlのDNA抽出液を加える
1分、緩やかに撹拌
10,000 rpm、3分遠心
上清に500 μlのエタノールを加え撹拌
10,000 rpm、1分遠心
沈渣をエタノールで2回洗浄
乾燥後100 μlのTE Bufferに溶解
PCR
   │
   │
   │
   │
   │
   │
   │
   │
   ↓


熱変性 94℃、30 sec
 
30 cycles
アニーリング 45℃、90 sec
伸 長 72℃、60 sec
熱変性 94℃、30 sec
 
10 cycles
アニーリング 45℃、90 sec
伸 長 72℃、60 sec
検 出
   │
   │
   ↓


アガロース電気泳動
EtBr染色
判 定
図1 胃生検材料からのPCR法によるHelicobacter pyloriの検出
■ 結果

従来のTaq DNA Polymeraseでは、バンドがほとんど認められない検体でも、TaKaRa Ex Taqを用いれば明瞭なバンドを確認することができた(図2)。


図2 耐熱性ポリメラーゼの種類による増幅率のちがい
Lane 1:H. pylori NCTC11637 Taq
Lane 2:胃生検(1)
Lane 3:胃生検(2)
Lane 4: 胃生検(3)
Lane 5:H. pylori NCTC11637 TaKaRa Ex Taq
Lane 6:胃生検(1)
Lane 7:胃生検(2)
Lane 8:胃生検(3)
Lane 9:マーカー


PCR反応液組成

Template DNA10 μl
TaKaRa Ex Taq or Taq DNA Polymerase2.5 U
10 × Ex Taq Buffer or PCR Buffer 
dNTP Mixture200 μl
forward and reverse primer*各0.2 μl
* ウレアーゼA遺伝子を増幅するプライマー
HPUA-1(5'-GCCAATGGTAAATTAGTT 3' : 304-321)
HPUA-2(5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC 3' : 714-697)

培養法とPCR法との具体的な検出感度の違いと問題点について、弊社定期発刊誌「BIO VIEW 17号」にて神戸市環境保健研究所 細菌部の黒川 学先生にご執筆いただいております。詳しくはそちらをご覧ください。

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