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Application

3'-Full RACE Core Set

ヒトトランスフェリンレセプターmRNAをターゲットにした3'-RACE

HL60由来total RNAを用いてヒトトランスフェリンレセプターmRNAをターゲットにして3'-RACE法を行った。

A.RT-PCR
  1. 逆転写反応
    Standard Protocolにしたがって反応液を調製し、逆転写反応を行う。

    サンプル:HL60由来total RNA(1 μg/μl)

    反応条件

    30℃、 1 min1 cycle
    50℃、30 min
    95℃、5 min
    5℃、 5 min
  2. PCR反応(TaKaRa LA Taq 使用)
    A. -1. の逆転写反応液を用いて下記の反応液を調製し、Standard ProtocolにしたがいPCR反応を行う。
    10×LA Taq Buffer II(Mg2+ free) 5 μl
    25 mM MgCl2 5 μl
    dNTP Mixture(2.5 mM each) 8 μl
    TaKaRa LA Taq(5 U/μl) 0.25 μl
    上流特異的プライマー*(20 μM) 0.5 μl
    3sites Adaptor Primer(20 μM) 0.5 μl
    1. の逆転写反応液 10 μl
    滅菌精製水 20.75 μl
    Total 50 μl
    * 5'末端にBamH I site含む配列を付加したプライマー
  3. 反応終了後、アガロース電気泳動により反応産物を確認する。
    Lane M:λ-Hind III digest
    1:3'-RACE PCR産物(約1.5 kbp)
    1%アガロースゲル電気泳動
    8 μl泳動
B.PCR産物の回収
DNA回収用フィルター付き遠心チューブを使用してPCR産物を精製する。
C.制限酵素消化

プラスミドベクター pUC118 BamH I/BAP(製品コード 3321)にサブクローニングするため、PCR産物のBamH I 処理を行う。 下記の反応液を調製し、30℃で1時間インキュベートする。

PCR産物2 μl(500 ng~1 μg)
10 U/μl BamH I 1 μl
10×Buffer K1 μl
滅菌精製水up to 50 μl
D.ライゲーション反応

pUC118 BamH I/BAPとC. のBamH I 処理PCR産物(約1.5 kbp)のライゲーション反応を行う。[DNA Ligation Kit Ver. 2 (製品コード 6022)使用]
下記の反応液を調製し、16℃で1時間反応させる。

C. で調製したPCR産物6.5 μl(200 ng)
pUC118 BAP処理DNA0.5 μl(50 ng)
Enzyme Solution I液7 μl
Total14 μl
E.形質転換

E. coli JM109 competent Cells(製品コード 9052)に形質転換を行った後、アンピシリン、IPTG、X-Galを含むLB-plateにスプレッドし、37℃、18時間培養する。培養後、白色コロニーを拾う。
M4 PrimerとRV PrimerによるPCRでインサートの確認されたコロニーをLB培地で培養後、プラスミドを回収する。
この塩基配列解析を行った結果、目的のフラグメントが挿入されていることが確認された。

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