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Application

M13 Primers

M13 Primer M4/RVを用いたPCR法により増幅したクローニング遺伝子の鎖長決定およびサブクローニング1)

操作手順
1.プレートよりM13ファージプラークを拾い、蒸留水200 μlに懸濁する。
2.室温で30分間放置し、ファージを溶出させる
3.溶出液50 μlを90℃で10分間処理後、M13 Primer M4/RVを用いたPCR法により、挿入遺伝子を増幅させる。
4.PCR反応液の一部をアガロース電気泳動にかけ、サイズを決定する(図1)。
5.サブクローニングは、PCR反応液の一部をEcoR I 処理し、あらかじめEcoR I 切断したプラスミドベクターとのライゲーション反応により、従来法に比べて簡便かつ容易に行うことができる。

図1 増幅遺伝子のアガロースゲル電気泳動
PCR条件

94℃、30 sec
55℃、 2 min
72℃、 1 min
25 cycles

Lane1:pHY Marker
2:insertなし(Blue colony)
3~9:未知のinsert DNA(White colony)
10:(Blue colony)
11:pHY Marker
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