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N末端ブロックタンパク質のN末端シーケンス解析法

Method II
N-pyroglutamyl基のデブロッキング法

Method Iでシーケンスが決定できなかった場合、Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase(製品コード 7334)を用いてN末端Pyroglutamyl基のデブロッキングを試みる。
この酵素はインタクトなタンパク質にダイレクトに作用することから、酵素反応後すぐにプロテインシーケンサーにより構造解析ができる。未知のN末端ブロック基の場合、2番目にトライすべき方法である。

方法

タンパク質(100 pmol-1 nmol)*
  ↓
PVDF膜を洗浄する(下記実験例参照)
  ↓
PVDF膜のunbound protein-binding siteをブロックする(下記実験例参照)
  ↓
Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase消化を行う
  ↓
プロテインシークエンサーにかける

* Method I終了後の試料を用いることができる。Method IIから始める場合、タンパク質試料が溶液状態であれば、酸処理、熱処理、還元アルキル化等の方法により変性させた後、PVDF膜にドットブロットする。

Pfu Pyroglutamate Aminopeptidaseの標準反応条件


緩衝液:10 mM DTT, 1 mM EDTAを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0
反応温度:50℃
酵素/基質:2~5 mU酵素/1 nmol基質
反応時間:5~10時間
実験例
PVDF膜にブロットされたEgg white riboflavin binding protein(RBP)のN末端デブロッキング
RBPはN末端がピログルタミン酸であり、分子量34,000である。(Pfu Pyroglutamate Aminopeptidaseを用いて)PVDF膜にブロットされたこのタンパク質のN末端ピログルタミン酸を切断した。

実験条件

500 pmol/ PVDF膜
  ↓
PVDF膜をサンプルチューブに入れ、60%メタノール 1 ml×2回、90%メタノール 1 ml×1回、手で振とうして洗浄する。
(90%メタノールは入れたらすぐ液を除く。:あまり長くメタノール液に浸しておくとサンプルが流れ出てしまうので注意が必要。)

0.5%(w/v)のpolyvinylpyrrolidone(PVP)-55含有100 mM酢酸溶液に500μlに37℃で30分間浸す。
 ↓
膜を蒸留水で少なくとも10回以上撹拌洗浄する。
 ↓
膜をメタノールで湿らせる。
 ↓
酵素消化を行う。
 |Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase(2 mU) 10 μl
 |100 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) 100 μl
 |100 mM DTT 20 μl
 |蒸留水 70 μl
 ↓total 200 μl
50℃で5時間インキュベートする。
 ↓
膜を蒸留水で3回撹拌洗浄する。
 ↓
シーケンサーでアミノ酸配列分析を行う。

結果

以下の結果からN末端ピログルタミン酸の次のアミノ酸からの配列を[<Q]QYG(C)LEGDTHと同定できた。
(<Q:ピログルタミン酸)
サイクルアミノ酸 収量(pmol)
1Gln 39.7
2Tyr 42.1
3Gly 37.5
4(Cys) -
5Leu 36.7
6Glu 77.7
7Gly 32.9
8Asp 56.6
9Thr 8.6
10His 16.3
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