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Anhydrotrypsin Agarose

注意:[1]各種ペプチドに対する親和力の比較

1. Anhydrotrypsin Agaroseによるbradykinin、tuftsinおよび[Arg-6]-Leucine enkephalinの分画1)

本製品は、C末端にArg(Lys、AECys)を有するペプチド混合物(例えばbradykinin、tuftsinおよび[Arg-6]-Leucine enkephalin)をpH5~6の条件下で特異的に結合し、溶出液のpHを徐々に下げることによってこれらのペプチドを別々に溶出させることが可能である。

■方法
ベッド体積 7.3 ml(0.9φ×11.5 cm);分画液量 1.0 ml;流速 10.0 ml/hr;温度 4℃
(1)開始Bufferで平衡化したゲルに各ペプチド100 nmolを含むペプチド混合液(pH5.0)0.9 mlを添加し、開始Buffer 25 mlで洗浄した。
(2)ゲルに吸着したペプチドは0.1 Mギ酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)15 mlと0.1 Mギ酸(pH2.5)15 mlからなる直線pH勾配によって溶出した。
(3)ゲルに強く吸着しているペプチドの溶出には0.1 Mギ酸(pH2.5)を用いた。
(4)ペプチドの検出は、fluorescamine反応による蛍光を測定することにより行った。

■結果
bradykininおよびtuftsinはpH3.3および2.9でそれぞれ溶出するが、[Arg-6]-Leucine enkephalinは0.1 Mギ酸(pH2.5)を使用した洗浄によって初めて溶出する(5 mM塩酸または0.1 Mギ酸(pH2.5)を使って、吸着させた全ペプチドを一斉に溶出させることも可能である)。

図2 Anhydrotrypsin Agaroseによるbradykinin、tuftsinおよび[Arg-6]-Leucine enkephalinの分画1)

2. 各種ペプチドのAnhydrotrypsin Agaroseからの溶出に必要なpH値2)
Anhydrotrypsin Agaroseに結合した各種ペプチドに直線pH勾配溶出を適用し、ペプチドが溶出されるpH値の測定結果を表1にまとめた。各ペプチドに対する吸着体の親和力がある程度比較できる。

■方法
ベッド体積 4.7 ml(0.86φ×8.1 cm);流速 10.0 ml/hr;温度 4℃
吸着条件:開始Buffer
溶出条件:(A)0.1 Mギ酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)20 ml
(B)0.1 Mギ酸(pH2.5)20 ml
(A)→(B)の直線pH勾配溶出
検出:fluorescamine反応による蛍光測定

表1 各種ペプチドのAnhydrotrypsin Agaroseからの溶出に必要なpH値2)

ペプチド

溶出pH値

Y-R

 5.0*

Bz-G-K

 5.0**

V-E-S-S-K

 4.0

Y-G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K

 3.8

M-K-R-P-P-G-F-S-P-F-R

 3.4

Y-G-G-F-L-R-K-Y-P-K

 3.2

P-F-G-K

 3.1

T-K-P-R

 2.9

Bz-G-R

 2.7

Y-G-G-F-L-R

 2.5

* ゲルにまったく吸着しない。
** pH5.0において5カラム体積の開始Bufferで溶出した。

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