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Application

シアル酸蛍光標識用試薬キット

Application2:ウシFetuin由来N-link糖鎖の分析

(1)N-link糖鎖の分析
ウシFetuinよりヒドラジン分解、N-アセチル化を行いN-link糖鎖を得た。得られた糖鎖をGlycoTAGを用いて2-アミノピリジンで蛍光標識した。PALPAK Type Nを用い、イオン交換モードでHPLC分析を行ったところ、図7のようなパターンが得られたので、図のようにasialo画分~tetrasialo画分をそれぞれ分取した。

図7 ウシFetuin由来PA化糖鎖のHPLC分析
(2)各画分のシアル酸量の定量
(1)で分取した画分の各約100 pmolを0.05 N HCl 50 μl中、80℃で1時間加熱し、部分酸水解によりシアル酸を遊離させた。キットのプロトコールに従って遊離したシアル酸のDMB標識を行い、HPLC分析した。得られた結果を表2に示した。
(3)各画分の還元末端PA-GlcNAcの定量
前述の方法(Application1:糖タンパク質由来PA化糖鎖スタンダードの分析(4))に従って、(1)で分取した画分の各約100 pmolを酸加水分解、N-アセチル化し、HPLC分析によって還元末端のPA-GlcNAc量を求めた(表2)。シアル酸量をPA-GlcNAc量で割り算し、糖鎖あたりの結合シアル酸の個数を求めたところ、各画分から0.16個、0.98個、1.86個、2.86個、4.26個という結果が得られた(表2)。

表2 ウシFetuin由来糖鎖の糖鎖あたりの結合シアル酸数
Neu5Ac
(pmol/μl)
PA-GlcNAc
(pmol/μl)
糖鎖あたりの結合
シアル酸数(個)
Asialo画分 1.01 6.41 0.16
Monosialo画分 8.23 8.45 0.98
Disialo画分 26.36 14.20 1.86
Trisialo画分 18.15 6.34 2.86
Tetrasialo画分 7.10 1.67 4.26
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