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Application

シアル酸蛍光標識用試薬キット

Application3:糖脂質由来PA化糖鎖スタンダードの分析

シアル酸は通常、酸に不安定なα結合によって複合糖質に結合しており、糖鎖末端に結合している場合50 mM塩酸中、80℃ 1時間の加熱で簡単に遊離する8)。ところが、糖脂質GM1に見られる-GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Gal-という構造で結合したシアル酸は、N-アセチルガラクトサミンとの立体障害のため加水分解を受けにくいことが知られている。Clostridium perfringensやVibrio cholerae由来のシアリダーゼ(α-2,3, α-2,6結合に特異的)を用いた場合、通常の酵素量ではシアル酸は遊離しない。また、部分酸水解の場合でもPA化糖鎖(GM1-PA)では図8に示すように1時間ではシアル酸は80%程度しか遊離せず、3時間でほぼ100%遊離することがわかる。
図8
25 pmolのGM1-PAを含む50 mM HCl 50 μlを80℃で加熱した時の遊離シアル酸量
シアル酸量はDMB化により測定

(1)脱シアル酸の条件
I.部分酸水解の条件
PA化糖鎖スタンダードPA-Sugar Chain 029、032、033、035、036、037各2.5 μl(約25 pmol相当)を次に示すA~Cの条件で部分酸水解を行った。
A:50 mM塩酸 50 μl中、80℃ 3時間
B:2M酢酸 50 μl中、80℃ 3時間
C:1Mギ酸 50 μl中、100℃ 1時間
A~Cの方法で得られた水解物をキットのプロトコールに従ってDMB標識し、HPLCによってシアル酸の定量を行った。結果を表3に示す。
II.酵素による加水分解
PA化糖鎖スタンダードPA-Sugar Chain 029、032、033、035、036、037各2.5 μl(約25 pmol相当)を、Arthro-bacter ureafaciens由来Sialidase 500 mUを含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)25 μl中で37℃ 30分間酵素反応を行った。100℃で3分間加熱することで反応を停止し、キットのプロトコールに従ってDMB標識し、HPLCによってシアル酸の定量を行った。結果を表3に示す。


図9
(2)遊離シアル酸のDMBによる蛍光標識とHPLC分析
IまたはIIで得られたサンプルをキットのプロトコールに従ってDMBで標識した。糖鎖1 pmolに相当する量を図2に示したHPLC条件で分析した。一例として、PA-Sugar Chain 029のHPLCの分析パターンを図9に示す。サンプルのHPLCのピークの高さとサンプルと同時に実験を行ったスタンダードのシアル酸のピークの高さを比較することによって、サンプル中のシアル酸の定量を行った。

図10
(3)NeuGcの分析
2.5μlのPA化糖鎖スタンダード030(約25 pmol相当)を濃縮乾固し、50 mM塩酸50 μlを加えて80℃で3時間加熱しNeuGcを遊離した。キットのプロトコールに従ってDMB標識しHPLC分析を行った。結果を図10に示す。DMB化によってNeu5AcだけでなくNeuGcの分析も行うことができる。

図11
(4)PA化糖鎖の還元末端の定量
PA-Sugar Chain 029、032、033、035、036、037 5 μl(約50 pmol相当)をガラスチューブに入れ濃縮乾固し、2 N塩酸/2 M TFA混合液50 μlを加えて減圧封管した。100℃ 6時間加熱し酸水解を行った。開管後、濃縮乾固させ水を少量加えて共沸した。さらに水を25μl加えて残渣を溶かし、そのうち5 μlを図3に示したHPLC条件で分析した。一例として、PA化糖鎖スタンダード032のHPLC分析パターンを図11に示す。サンプルのHPLCのピークの高さと、サンプルと同時に実験を行ったスタンダードのPA-Glcのピークの高さを比較することによって、還元末端のPA-Glcの定量を行った。結果を表3に示す。

(5)糖鎖あたりの結合シアル酸量
(2)で求めたシアル酸量を還元末端量で割り算することによって糖鎖1モルあたり結合しているシアル酸のモル数を求めることができる(表3)。表3の結果より、-GalNAcβ1-4(-Neu5Acα2-3)Gal-という構造をもつPA化糖鎖032、033、036、037は、もたない糖鎖(029、035)に比べて若干シアル酸のモル数が低く検出される傾向があるが、50 mM塩酸中 80℃ 3時間で部分酸水解を行ったサンプルの結果は良好であった。
表3
I. 部分酸水解によるシアル酸量(pmol/μl) II. シアリダーゼ消化によるシアル酸量
(pmol/μl)
(4)還元末端量PA-Glc
(pmol/μl)
糖鎖あたりの結合シアル酸数(個)
A B C A B C シアリダーゼ消化
029 13.88 13.05 12.02 13.24 13.71 1.01 0.95 0.88 0.97
032 9.11 6.01 6.20 6.16 8.62 1.06 0.70 0.72 0.71
033 26.38 22.12 24.76 20.36 13.08 2.02 1.69 1.89 1.56
035 31.83 30.75 30.24 30.19 15.77 2.02 1.95 1.92 1.91
036 37.00 35.37 36.35 33.05 13.93 2.66 2.54 2.61 2.37
037 50.19 46.99 48.86 45.02 13.76 3.65 3.41 3.55 3.27
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