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Refolding CA Kit

実施例1:酵素のリフォールディング実験

Refolding CA Kit(製品コード 7350)

(1)Citrate Synthaseの場合

【アンフォールディングとリフォールディング】
2.4 mg/mlのCitrate Synthaseの硫酸アンモニウム懸濁液を24 μlとり、前述の操作法に従って変性剤を加えてアンフォールディングした。室温で1時間放置した。そのうちのそれぞれ20 μlに、1.4 mlの非イオン性界面活性剤溶液(終濃度0.05%のTween 40あるいはTween 60を含む158 mM Tris-HCl、pH7.6)を加えてさらに室温で1時間放置した。次に、種々の濃度のCAを加え、室温で16時間(一晩)放置してリフォールディングを行った。遠心して上清を集め、酵素活性を測定した。

【酵素活性の測定】
反応液の組成:
・158 mM Tris-HCl (pH7.6)
・0.023 mMアセチルCoA
・0.5 mMオキサロ酢酸
・0.12 mMジチオビス
この反応液にリフォールディングさせたCitrate Synthaseを加え、412 nmの吸光度の変化を経時的に測定した。変性処理をせずに適当な緩衝液中で酵素を同じ倍率に希釈した場合の酵素活性を100%として、変性およびリフォールディングを行った酵素の相対活性を求めた。

【結果】
界面活性剤としてTween 40およびTween 60を用い、CAを0.6%の終濃度(本キットのプロトコールで推奨している濃度)で用いた場合におけるCitrate Synthaseの相対活性は、それぞれ86%、100%であった。(図1)
CA終濃度
(%)
相対活性(%)
Tween 40Tween 60
000
0.233.134.7
0.466.280.0
0.686.2100
0.888.5100
110098.0
本キットのプロトコールで推奨しているCA濃度は0.6%である(
の場合に相当)。
図1 Citrate Synthaseのリフォールディング実験


(2)Lysozymeの場合

【アンフォールディングとリフォールディング】
15 mg/mlのLysozyme水懸濁液を24 μlとり、(1)の場合と同様に変性剤で処理した。そのうちの20μlをとり、1.4 mlの陽イオン界面活性剤溶液(終濃度0.05%のCTABと2 mMのDL-Cystineを含むTris-acetate、pH7.6)を加えてさらに室温で1時間放置した。次に、種々の濃度のCAを加え、室温で16時間(一晩)放置してリフォールディングを行った。遠心して上清を集め、酵素活性を測定した。

【酵素活性の測定】
反応液の組成:
・0.16 mg/ml Micrococcus lysodeikticus乾燥菌体/50 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)

この反応液にリフォールディングさせたLysozymeを加え、450 nmの吸光度の変化を経時的に測定した。変性処理をせずに適当な緩衝液中で酵素を同じ倍率に希釈した場合の酵素活性を100%として、変性およびリフォールディングを行った酵素の相対活性を求めた。

【結果】
界面活性剤としてCTABを用い、CAを0.6%の終濃度(本キットのプロトコールで推奨している濃度)で用いた場合におけるLysozymeの相対活性は88%であった。(図2)
CA終濃度 (%) 相対活性(%)
00
0.133.3
0.356.7
0.688.3
0.990.8
1.287.1
本キットのプロトコールで推奨しているCA濃度は0.6%である(
の場合に相当)。

図2 Lysozymeのリフォールディング実験

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