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Application

Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)

鎖長の異なるフラグメントのクローニング例
Mighty Cloning Kit (Blunt End) 製品コード 6026

(A)PCR産物をそのまま使用した場合

λ DNAを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いて500 bp、1 kbp、2 kbp、4 kbp、6 kbpの領域をPCR増幅した。それぞれの反応液2 μlを本キットのプロトコールに従って平滑化、リン酸化し、pUC118 HincII / BAPにクローニング後、E. coli JM109 コンピテントセルを形質転換してカラーセレクションを行った。なお、インサートの有無はPCR(プライマー ; M13 Primer M4およびRV)によって確認した。
インサートDNA鎖長 白色コロニー/青色コロニー
(/50 ng pUC118 DNA)
インサート/白色コロニー
500 bp1.8×105 / 8.8×10310 / 10
1 kbp1.2 ×105 / 5.8×10310 / 10
2 kbp2.2 ×104 / 7.5×1038 / 10
4 kbp1.8 ×104 / 1.4×1049 / 10
6 kbp8.9 ×103 / 2.0×1048 / 10
※使用したコンピテントセルは3.9×108 コロニー/μg pUC118 DNAの形質転換効率を持つ。

(B)アガロースゲルから回収したフラグメントを用いた場合

λ DNAを鋳型としてTaKaRa Ex Taqを用いて増幅した500 bp、及びヒトGenomic DNAを 鋳型としてPrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いて増幅した2 kbpのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動後、EASYTRAP Ver.2を使用してゲルから回収した。500 bpは2 pmol相当(約660 ng)、2 kbpは0.2 pmol相当(約250 ng)のDNAを本キットのプロトコールに従って平滑化、リン酸化し、pUC118 Hinc II / BAPにクローニング後、 E. coli JM109 コンピテントセルを形質転換してカラーセレクションを行った。なお、インサートの有無はPCR(プライマー ; M13 Primer M4およびRV)によって確認した。
インサートDNA鎖長 白色コロニー/青色コロニー
(/50 ng pUC118 DNA)
インサート/白色コロニー
500 bp1.3×105 / 4.6×10310 / 10
2 kbp1.6×104 / 7.1×103 9 / 10
※使用したコンピテントセルは4.6 × 108 コロニー/μg pUC118 DNAの形質転換効率を持つ。
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