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実験例-3 8 kbの欠失変異体の作製

【方法】

pUC118 DNAのHinc IIサイトに8 kb断片を挿入したプラスミドを鋳型とし、その8 kbを欠失した変異体の取得を試みた。前述のプライマー設計方法に基づいて作製した変異導入プライマーを用い、プラスミド100 pgを鋳型としてPrimeSTAR MaxによるPCR増幅を行った(50 μl反応系)。その2 μlをE. coli JM109コンピテントセル100 μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1 mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100 μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X-gal)上で培養し、青コロニー(変異導入体)と白コロニー(バックグラウンド)をカウントした。さらに、得られた青コロニー(変異導入体)10個よりそれぞれプラスミドを調製し、プラスミドサイズおよびHinc IIサイトの復活を確認した。

【結果】

プラスミド100 pgを鋳型とした場合、変異導入体(青コロニー)158個に対しバックグラウンド(白コロニー)は3個で、98%の確率で変異体が取得できた。変異導入体(青コロニー)10個より取得したプラスミドはすべて8 kbが欠失したサイズのプラスミドであり(図A)、Hinc IIで1箇所切断されて3.2 kbのDNA断片が得られることから(図B)、正しく変異導入(欠失)できていることが確認できた。
プラスミドサイズの確認(non-cutで電気泳動)
図A プラスミドサイズの確認(non-cutで電気泳動)
レーン
1:変異導入前
2~11:変異導入後
M:λ-Hind III digest

Hinc II切断後の電気泳動
図B Hinc II切断後の電気泳動 レーン
レーン
1:変異導入前
2~11:変異導入後
M:λ-Hind III digest
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