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クルードサンプルでの増幅例3:ヒト爪からSimplePrep™ reagent for DNAで調製した抽出液

MightyAmp DNA Polymerase(製品コード R071A/B、R070A/B)
 
【方法】
ヒト爪5 mg にSimplePrep reagent for DNA(製品コード 9180)を44 μl添加し、標準プロトコールに従って37℃ 6分、95℃ 3分インキュベートした後、滅菌水を80 μl添加し混合した。上清(抽出液)2.5 μlを鋳型として(25 μl反応系)、1 kb(GC 含量26%、50%および72%)、2 kb(GC 含量27%、50%および69%)、4 kb(GC含量 33%、44%および63%)の領域をターゲットに、本酵素とA社およびB社阻害物質耐性酵素を用いてそれぞれ推奨条件でPCR増幅を行った。各反応液3 μlを電気泳動に供し、反応性を比較した。
【結果】
A社およびB社阻害物質耐性酵素ではターゲットの鎖長やGC含量によっては増幅不可や増幅不良の結果となったが、MightyAmp DNA Polymeraseではすべてのターゲットに対し目的サイズの増幅結果を得ることができた。DNA抽出が難しいヒト爪から簡便な操作で調製した抽出液が鋳型の場合でも、MightyAmpを用いることで、特異的増幅が難しいGCリッチやATリッチなターゲットであっても効率よくPCR増幅することができた。

図3.ヒト爪からのSimplePrep reagent for DNAによる簡易調製抽出液を鋳型としたPCR増幅

[ ターゲット遺伝子 増幅サイズ(GC含量)]
レーン1 :UCRchr9*11.1 kb(26%)レーン6 :IGFβ12.0 kb(69%)
2 :EGFR1.0 kb(50%)7 :FragileX4.0 kb(33%)
3 :TGFβ11.0 kb(72%)8 :EGFR3.8 kb(44%)
4 :UCRchr11*22.2 kb(27%)9 :TGFβ14.0 kb(63%)
5 :IGF2R2.0 kb(50%)M :pHY Marker

  *1 UCRchr9:9 番染色体 AT リッチなuncoding region
  *2 UCRchr11:11 番染色体 AT リッチなuncoding region
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