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SapphireAmp®を用いたコロニーPCR

SapphireAmp® Fast PCR Master Mix(製品コード RR350A/B)
マウスcDNA由来pUC118ライブラリー(0.5 kb~5 kbのフラグメントを挿入)を形質転換した大腸菌コロニーに対し、コロニーPCRによるインサートチェックを行った。
  1. 反応数+α分のマスターミックスを調製し、50 μlずつPCRチューブに分注しておく。

    例)8サンプルの反応を行う場合
    1反応分9反応分
    SapphireAmp Fast PCR Master Mix(2×Premix)25 μl225 μl
    M13 Primer M4(20 μM)0.5 μl4.5 μl
    M13 Primer RV(20 μM)0.5 μl4.5 μl
    dH2O(滅菌水)24 μl216 μl
  2. 大腸菌コロニーを滅菌マイクロチップの先でごく少量掻きとり、1. のPCRチューブの反応液に懸濁してPCRを行う。
    PCR条件
    94℃ 1 min.
     ↓
    98℃ 5 sec.
    55℃ 5 sec.
    72℃ 40 sec.
     
    30 cycles
    (PCR所要時間:1時間11分、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice使用)

    電気泳動結果

    反応液5 μl泳動   1% Agarose L03

    1~8コロニーPCR
    M250 bp DNA Ladder (Dye Plus)

    電気泳動にて各種サイズ(0.5 kb~5 kb)の増幅産物が確認できた。
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