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Application

Human iPS Cell Generation™ Episomal Vector Mix

ヒト末梢血単核球細胞からのT細胞を標的としたiPS細胞の樹立

<方法>
本製品(Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix、製品コード3673)を使用し、成人由来の正常ヒト末梢血単核細胞からiPS細胞を誘導した。
Feeder細胞としてはMEFを使用した。

 【プロトコール】
(Day -1)Feeder細胞の準備
  1. 6 well tissue culture plateに0.1%ゼラチン水溶液を添加し、37℃で30分間インキュベートした。
  2. 6 well tissue culture plateから0.1%ゼラチン水溶液を吸引除去した。
  3. 2. のゼラチンコート済み6 well tissue culture plateに、10% FBS/DMEM培地を用いてFeeder細胞を3×105個/wellで播種した。
  4. インキュベーター(37℃、5% CO2)で一晩培養し、細胞を容器底面に接着させた。

(Day 0)エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
凍結単核球の解凍
  1. 9 mlのX-VIVO 15(IL-2、CD3/CD28 beads不含)を15 mlチューブに分注した。
  2. 凍結単核球のバイアルを37℃の湯浴槽で融解した。
  3. 少し氷が残るくらいで湯浴槽から引き上げ、1.の培地に融解済みの細胞懸濁液を加えた。
  4. 200×g、18℃で10分間遠心した。
  5. 上清を吸引除去した。
  6. 5 mlのX-VIVO 15(IL-2、CD3/CD28 beads不含)に懸濁した。
  7. 細胞数を計測した。

エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
  1. 15 mlチューブに単核球用培地を0.9 ml分注し、37℃の湯浴槽にて加温した。
  2. Day -1で準備したFeeder 細胞より培地を吸引除去し、単核球用培地を2 ml添加した。
  3. 15 mlチューブに単核球3×106個を分注した。
  4. 200×g、室温で10分間遠心した。
    この間にエレクトロポレーション液(T細胞用)を作製した。
    Human T cell Nucleofector solution82 μl
    Supplement18 μl
    Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix3.5 μl
  5. 遠心終了後、上清を完全に取り除いた。
  6. 3. のエレクトロポレーション液(T細胞用)に細胞を懸濁して、キュベットに移した。
  7. Nucleofector II Deviceにキュベットを差し込み、プログラムV-024にてエレクトロポレーションを実施した。
  8. 1. の単核球用培地に、エレクトロポレーション後の細胞を素早く懸濁した。
  9. 2. で準備したFeeder細胞上に細胞を播種し、インキュベーター(37℃、5%)で培養した。

(Day 2、4、6)ヒトiPS細胞培養用培地の追加
ヒトiPS細胞培養用培地1.5 mlを静かに添加した。

(Day 8)ヒトiPS細胞培養用培地への交換
培地を吸引除去し、ヒトiPS細胞培養用培地2 mlを添加した。
以降、培地の交換は2日に1回行った。
<結果>
経時的な細胞形態の変化を撮影した写真を以下に示す。

Day0(播種直後:Feeder上にまばらに細胞が点在していた。
Day0(播種直後)

Day4:細胞増殖が認められた。
Day4

Day13:iPS細胞様のコロニーが観察されはじめた。
Day13

Day24:iPS細胞のコロニーが観察された。
Day24 Day24

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