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ユーザー様実施例;CRISPR/Cas9 Gesicleを用いたHepG2改変株の標的遺伝子ノックアウト

目的:ゲノム編集によるHepG2改変株(HepG2-hNTCP-C4細胞)の標的遺伝子ノックアウト

方法:Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production Systemを用いてHepG2改変株で標的遺伝子のノックアウトを行った。
編集対象細胞は24 well collagen I coating plateで、50%コンフルエントになるように培養した。
添付のProtamine溶液を培地に添加後、本製品を用いて作製したCRISPR/Cas9 Gesicle 30 μlを加え、製品のプロトコール通りに遠心した。
24時間後、顕微鏡下で赤色蛍光の発現を確認し、導入から72時間後に限界希釈により61クローンの単離を行った。
単離したクローンは増殖後、ゲノムを抽出し、ダイレクトシーケンスで配列を確認した。

結果:61クローン中25クローンにて、標的遺伝子への変異導入(ヘテロ)が確認できた。
同時に検討した、同じsgRNA配列を用いたI社製品によるsgRNAとCas9タンパク質の導入方法では、40クローン中3クローンでヘテロ変異導入が確認された。Gesicleを用いた導入法の方が高い編集効率が得られた(図1)。

GesicleとI社製品(RNPトランスフェクション法)を使用した際の変異導入率の比較
図1. GesicleとI社製品(RNPトランスフェクション法)を使用した際の変異導入率の比較
Gesicleを用いた導入法では41%という高い変異導入率が確認された。

データご提供:
国立研究開発法人 理化学研究所 統合生命医科学研究センター 消化器疾患研究チーム様
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