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In-Fusion簡易プロトコールによる2断片の同時クローニング

方法
In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer(製品コード 639633)を用いて、インバースPCRで増幅したベクター2.7 kbに1 kbと2 kbのPCR増幅断片を連結させるIn-fusion反応をStandard ProtocolとQuick Protocolで行った。各DNA断片のPCR増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品コード R045A)を使用した。形質転換にはE. coli HST08 Premium Competent Cells(製品コード 9128)を使用した。
2.7 kbのVectorと1 kbと2 kbのPCR断片電気泳動写真
Standard Protocol
CE treatment
PCR product 5 μl
Cloning Enhancer 2 μl
37℃ 15 min
80℃ 15 min
In-Fusion reaction
5× In-Fusion Reaction Premix2 μl
CE treated Vector1 μl
CE treated Insert1+1 μl
dH2O (as needed)5 μl
Total volume10 μl
50℃ 15 min
Quick Protocol
CE treatment and In-Fusion reaction
5× In-Fusion Reaction Premix2 μl
CE treated Vector1 μl
CE treated Insert1+1 μl
Croning Enhancer1 μl
dH2O (as needed)4 μl
Total volume10 μl
37℃ 15 min
50℃ 15 min

結果
In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancerを用いて、正確性が極めて高いPrimeSTAR Max DNA PolymeraseでPCR増幅したDNA断片を、そのまま、1チューブで30分(37℃15分、50℃15分)インキュベートして形質転換することで、ベクターに高効率に2断片を同時クローニングできた。
ProtocolCE treatmentIn-FusionInsertColonies 1/5 platingInsert check
Standard37℃ 15 min
80℃ 15 min
50℃ 15 min1K+2K25610/10
Quick37℃ 15 min
50℃ 15 min
1K+2K54410/10


※Quick Protocol はベクター、インサートともPCR増幅されたDNA断片の場合に限り行うことができる。
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