MightyAmp for FFPE｜タカラバイオ株式会社

FFPE組織切片からのPCRに

MightyAmp™ for FFPE

メーカー略称	製品コード	TaKaRa Code	製品名	容量	価格（税別）	特記事項	説明書データシートベクター情報	参考資料
TKR	R073A	R073A	MightyAmp™ for FFPE	40回	￥21,000	代替品：R076A 在庫なくなり次第終売
TKR	R073B(A×4)	R073B(A×4)	MightyAmp™ for FFPE	160回	￥68,000	代替品：R076B(A×4) 在庫なくなり次第終売

製品説明

本製品は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）からDNAを簡便に抽出してPCR増幅を行うための製品である。
クルードサンプルに対して強力な増幅性を示すMightyAmp DNA PolymeraseとFFPEサンプル用に最適化した専用バッファー、ならびにパラフィン包埋組織切片から効率よくDNAを抽出するための試薬で構成されている。専用バッファーには、パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出液に含まれるPCR阻害物質を中和する成分が含まれている。
本製品を使用することにより、煩雑で時間を要する脱パラフィンおよびDNA精製操作を行うことなく、簡便かつ短時間のDNA抽出操作だけで、パラフィン切片に含まれる少量のDNAから良好なPCR増幅が可能となる。多検体の解析にも便利である。
MightyAmp DNA Polymeraseは、98℃までポリメラーゼ活性を抑制する強力なモノクローナル抗体を用いたホットスタートPCR用酵素である。

【注意】	パラフィン包埋組織切片由来のDNAは、固定や包埋処理、DNA抽出操作によってダメージを受けているため、長鎖DNA増幅用の鋳型としては適していない。増幅鎖長が約500 bp以下のPCR増幅を推奨する。

内容

（40回用）^*1

MightyAmp DNA Polymerase（1.25 U/μl）^*2	40 μl
2×MightyAmp Buffer for FFPE（Mg^2＋、dNTP plus）^*3	1 ml
Extraction Buffer for MightyAmp FFPE	8 ml
20 mg/ml Proteinase K	40 μl

*1 反応容量50 μlでの回数
*2 【酵素の形状】

50 mM	Tris-HCl緩衝液（pH8.2 at 4℃）
100 mM	NaCl
0.1 mM	EDTA
1 mM	DTT
0.1％	Tween 20
0.1％	Nonidet P-40
50％	Glycerol

【活性の定義】
活性化サケ精子DNAを鋳型／プライマーとして用い、74℃において30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1 Uとする。

*3 Mg^2＋濃度は4 mM（2×）、dNTP濃度は各800 μM（2×）

保存

－20℃
Extraction Buffer for MightyAmp FFPEは開封後室温保存

操作

1. パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出

操作は室温で行う。反応にはサーマルサイクラーなどを利用する。

1．

スライド上のパラフィン切片^*1を滅菌したスパーテル等で削り取り、100 μlのExtraction Buffer for MightyAmp FFPEが入ったPCRチューブに加える。

【注意】	Extraction Buffer for MightyAmp FFPEが沈殿物を形成している場合は、加温して（～60℃）静かに撹拌し沈殿物を溶解する。

2．

20 mg/ml Proteinase K 1 μlを添加する。

3．

60℃で15分間インキュベートした後、98℃で5分間処理する。

4．

室温で沈殿が落ちる程度に軽く遠心し、上清（パラフィン抽出上清）をPCRの鋳型とする^*2。

*1	パラフィン包埋組織切片は1～1.5 cm²相当量を使用する。パラフィン切片量が多い場合は、Extraction Buffer for MightyAmp FFPEとProteinase Kの使用量を増やす。
*2	パラフィン抽出上清を保存する場合は、別のチューブに移して－20℃で保存する。

2. 一般的なPCR反応液組成（Total 50 μl）

	使用量	最終濃度
2×MightyAmp Buffer for FFPE	25 μl	1×
Primer 1	15 pmol	0.3 μM
Primer 2	15 pmol	0.3 μM
パラフィン抽出上清^*1	≦5 μl
MightyAmp DNA Polymerase	1 μl	1.25 U/50 μl
滅菌水	up to 50 μl

*1	パラフィン抽出上清のPCR反応液への持ち込み量は反応液の1/10量以下とする。

プライマー設計について

できるだけOLIGO Primer Analysis Software（Molecular Biology Insights社）などのプライマー設計ソフトを利用して、最適な配列を選択する。
Tm値（下記の式で計算）が60℃以上になるように設計することを推奨する。
Tm値（℃）＝ [（A、Tの数）×2]＋[（G、Cの数）×4]－5

MightyAmp DNA Polymeraseの場合、イノシンを含むプライマーの使用は避ける。

PCR条件

伸長温度を68℃に設定した3 step PCRが標準条件である。

[ 3 step PCR ]

98℃	2 min. ^*1
↓
98℃	10 sec.	40 cycles
60℃	15 sec.
68℃^*2	30 sec.^*3

*1 強力なホットスタート抗体を使用しているため、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させる。
*2 3 step PCRの場合も、伸長時間は68℃に設定する。
*3 500 bp以下の増幅の場合の伸長時間

増副産物の電気泳動

MightyAmp DNA Polymeraseを用いて増幅したPCR産物を電気泳動する場合は、TAE Bufferの使用を推奨する。TBE Bufferを使用すると、泳動パターンがやや裾広がりになり、きれいな泳動結果が得られない場合がある。

PCR産物について

MightyAmp for FFPEを用いて増幅したPCR産物のほとんどは3’末端にAが1塩基付加されている。そのため、PCR産物をそのままT-Vector [pMD20（製品コード 3270）、pMD19 (Simple)（製品コード 3271）など] にクローニングすることができる。また、Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（製品コード 6027）で平滑末端化およびリン酸化を行って、平滑末端のベクターにクローニングすることも可能である。

トラブルシューティング

現象	問題点	対策
増幅しない増幅効率が悪い	プライマーのTm値	上記の式を参考にプライマーを設計する
	アニーリング温度	2℃ずつ下げてみる
	サンプルの量	サンプルの使用量を減らす、または増やす
非特異的増幅が著しい	プライマーのTm値	上記の式を参考にプライマーを設計する
サイクル数	サイクル数を35～40 cyclesに設定