FFPE組織切片からのPCRに

MightyAmp™ for FFPE

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略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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参考
資料
TKR R073A R073A MightyAmp™ for FFPE
40回 ¥21,000
代替品:R076A
在庫なくなり次第終売
説明書・データシート・ベクター情報
TKR R073B(A×4) R073B(A×4) MightyAmp™ for FFPE
160回 ¥68,000
代替品:R076B(A×4)
在庫なくなり次第終売
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)からDNAを簡便に抽出してPCR増幅を行うための製品である。
クルードサンプルに対して強力な増幅性を示すMightyAmp DNA PolymeraseとFFPEサンプル用に最適化した専用バッファー、ならびにパラフィン包埋組織切片から効率よくDNAを抽出するための試薬で構成されている。専用バッファーには、パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出液に含まれるPCR阻害物質を中和する成分が含まれている。
本製品を使用することにより、煩雑で時間を要する脱パラフィンおよびDNA精製操作を行うことなく、簡便かつ短時間のDNA抽出操作だけで、パラフィン切片に含まれる少量のDNAから良好なPCR増幅が可能となる。多検体の解析にも便利である。
MightyAmp DNA Polymeraseは、98℃までポリメラーゼ活性を抑制する強力なモノクローナル抗体を用いたホットスタートPCR用酵素である。

【注意】 パラフィン包埋組織切片由来のDNAは、固定や包埋処理、DNA抽出操作によってダメージを受けているため、長鎖DNA増幅用の鋳型としては適していない。増幅鎖長が約500 bp以下のPCR増幅を推奨する。

内容

(40回用)*1
MightyAmp DNA Polymerase(1.25 U/μl)*240 μl
2×MightyAmp Buffer for FFPE(Mg2+、dNTP plus)*31 ml
Extraction Buffer for MightyAmp FFPE8 ml
20 mg/ml Proteinase K40 μl

*1 反応容量50 μlでの回数
*2 【酵素の形状】
50 mMTris-HCl緩衝液(pH8.2 at 4℃)
100 mMNaCl
0.1 mMEDTA
1 mMDTT
0.1%Tween 20
0.1%Nonidet P-40
50%Glycerol
【活性の定義】
活性化サケ精子DNAを鋳型/プライマーとして用い、74℃において30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1 Uとする。
*3 Mg2+濃度は4 mM(2×)、dNTP濃度は各800 μM(2×)

保存

-20℃
Extraction Buffer for MightyAmp FFPEは開封後室温保存

操作

1. パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出

操作は室温で行う。反応にはサーマルサイクラーなどを利用する。

1. スライド上のパラフィン切片*1を滅菌したスパーテル等で削り取り、100 μlのExtraction Buffer for MightyAmp FFPEが入ったPCRチューブに加える。
【注意】 Extraction Buffer for MightyAmp FFPEが沈殿物を形成している場合は、加温して(~60℃)静かに撹拌し沈殿物を溶解する。
2. 20 mg/ml Proteinase K 1 μlを添加する。
3. 60℃で15分間インキュベートした後、98℃で5分間処理する。
4.室温で沈殿が落ちる程度に軽く遠心し、上清(パラフィン抽出上清)をPCRの鋳型とする*2

*1 パラフィン包埋組織切片は1~1.5 cm2相当量を使用する。パラフィン切片量が多い場合は、Extraction Buffer for MightyAmp FFPEとProteinase Kの使用量を増やす。
*2 パラフィン抽出上清を保存する場合は、別のチューブに移して-20℃で保存する。


2. 一般的なPCR反応液組成(Total 50 μl)


使用量最終濃度
2×MightyAmp Buffer for FFPE 25 μl
Primer 115 pmol0.3 μM
Primer 215 pmol0.3 μM
パラフィン抽出上清*1≦5 μl
MightyAmp DNA Polymerase1 μl1.25 U/50 μl
滅菌水up to 50 μl

*1 パラフィン抽出上清のPCR反応液への持ち込み量は反応液の1/10量以下とする。

プライマー設計について

  • できるだけOLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights社)などのプライマー設計ソフトを利用して、最適な配列を選択する。
    Tm値(下記の式で計算)が60℃以上になるように設計することを推奨する。
    Tm値(℃)= [(A、Tの数)×2]+[(G、Cの数)×4]-5


  • MightyAmp DNA Polymeraseの場合、イノシンを含むプライマーの使用は避ける。

PCR条件

伸長温度を68℃に設定した3 step PCRが標準条件である。

[ 3 step PCR ]
98℃2 min. *1

98℃10 sec. 40 cycles
60℃15 sec.
68℃*230 sec.*3


*1 強力なホットスタート抗体を使用しているため、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させる。
*2 3 step PCRの場合も、伸長時間は68℃に設定する。
*3 500 bp以下の増幅の場合の伸長時間

増副産物の電気泳動

MightyAmp DNA Polymeraseを用いて増幅したPCR産物を電気泳動する場合は、TAE Bufferの使用を推奨する。TBE Bufferを使用すると、泳動パターンがやや裾広がりになり、きれいな泳動結果が得られない場合がある。

PCR産物について

MightyAmp for FFPEを用いて増幅したPCR産物のほとんどは3’末端にAが1塩基付加されている。そのため、PCR産物をそのままT-Vector [pMD20(製品コード 3270)、pMD19 (Simple)(製品コード 3271)など] にクローニングすることができる。また、Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)(製品コード 6027)で平滑末端化およびリン酸化を行って、平滑末端のベクターにクローニングすることも可能である。

トラブルシューティング

現象問題点対策
増幅しない
増幅効率が悪い
プライマーのTm値上記の式を参考にプライマーを設計する
アニーリング温度 2℃ずつ下げてみる
サンプルの量サンプルの使用量を減らす、または増やす
非特異的増幅が著しいプライマーのTm値上記の式を参考にプライマーを設計する
サイクル数サイクル数を35~40 cyclesに設定

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