DNA Topoisomerase I

  • ●反応用バッファー添付
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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ベクター情報
参考
資料
TKR 2240A 2240A DNA Topoisomerase I
100 U ¥17,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 2240B(A×5) 2240B(A×5) DNA Topoisomerase I
500 U ¥65,000
説明書・データシート・ベクター情報

保存

-20℃

濃度

20 U/μl

形状

20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)
50 mMKCl
0.05 mMEDTA
1 mMDTT
0.02%BSA
50%グリセロール

添付Buffer組成(10×)

350 mMTris-HCl、pH8.0
720 mMKCl
50 mMMgCl2
50 mMDTT
50 mMスペルミジン
0.1%BSA[別添付]

触媒する反応

1.環状のスーパーコイル分子のスーパーコイル状態を解消する。
2.一本鎖の環状DNA分子内に、DNA鎖の結び目を作ったり(knotting)、それをほどいたりする(unknotting)作用がある。
3.互いに相補的な塩基配列を持つ環状一本鎖DNAから、二本鎖の閉環状DNA分子を形成する反応を行う。
4.2つの環状二本鎖DNA分子のどちらかの分子にDNA鎖の切れ目が存在する場合、2つの分子の連結反応(catenation)、あるいはその逆の反応(decatenation)を起こす。
(参考文献3)より引用)

活性の定義

0.5 μg/50 μlのsupercoiled pBR322 DNAを37℃で30分間に100% relaxed formに転換させる酵素活性を1 Uとする。

活性測定用反応液組成

35 mMTris-HCl(pH8.0)
72 mMKCl
5 mMMgCl2
5 mMDTT
5 mMスペルミジン
0.01%BSA
0.5 μg/50 μlsupercoiled pBR322 DNA

純度

24 Uの本酵素と、0.5 μgのsupercoiled pBR322 DNAとを37℃、24時間反応させても、EtBr存在下でのDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。

使用上の注意

  • 添付反応液にはスペルミジン(終濃度5 mM)が添加してある(スペルミジンを反応液に添加しない場合、活性が1/20程度に低下することがある)。
  • pBR322 DNAやΦX174 DNAのRF I(スーパーコイル分子)を、DNA Topoisomerase I で反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行うと、ゲル中にエチジウムブロマイド(EtBr)が含まれている場合、反応の前後でバンドの位置に変化が起こらない。
    これは、DNA Topoisomerase I によりrelax型に転換したDNAが、EtBrの影響で再びスーパーコイル状態になってしまうからである。
    そのためDNA Topoisomerase I 活性を測定するときは、EtBrを含まないアガロースゲルで電気泳動を行い、泳動終了後EtBrで染色をすることが必要である。
  • 10×添付Bufferに0.1%ウシ血清アルブミン溶液を直接加えると多量の白沈が生じるので、反応液を調製する際は次の順番で試薬を加える。
        滅菌精製水→10×添付Buffer→0.1% BSA→基質DNA
  • 本酵素はガラスやプラスチックに対する吸着性が強く、反応に際しては、ウシ血清アルブミン(BSA)を添加することが望ましい。

用途

  • DNAのコンフォメーションの変換と解析

起源

Calf thymus1, 2)

一般的性質

  • 阻害剤
    0.2 M以上の一価カチオン(K、Na

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